南京林业大学，最新Nature Protocols！

近日，南京林业大学化学工程学院中比先进生物医用材料国际联合实验室黄超伯、熊燃华团队在国际权威期刊Nature Protocols（译名《自然协议》，影响因子13.1）发表了题为“Photothermal nanofiber-mediated photoporation for gentle and efficient intracellular delivery of macromolecules”的研究成果。化工院青年教师缪东洋为该论文第一作者，熊燃华教授为论文唯一通讯作者，南京林业大学为第一完成单位。该成果得到国家自然科学基金、江苏省自然科学基金等项目的资助。

功能性生物大分子胞内递送是生物药物领域面临的一个关键技术难题，研究团队前期利用光热纳米颗粒（NPs）富集于细胞表面进行光穿孔，光热NPs产生的瞬时光热效应可以将功能性生物大分子温和地递送至活细胞中，适用于多种细胞类型和生物大分子。然而，该光穿孔技术依赖于细胞与光热NPs的直接接触，这在临床应用中，特别是在癌症患者自体免疫T细胞功能化改造过程中，面临安全性和监管的诸多挑战。

为此，研究团队创新性地提出了一种基于光热静电纺纳米纤维（PEN）介导的光穿孔技术。该技术通过将光热NPs嵌入静电纺纳米纤维中，作为细胞培养的基底，利用光热效应诱导细胞膜透化，进而有效递送生物大分子至各种细胞类型。与传统方法相比，该技术避免了细胞与NPs的直接接触，从而显著降低了安全性和监管风险。与常用的物理转染方法——电穿孔相比，PEN光穿孔对细胞的损伤更小，能够获得更高质量的工程化改造细胞，展现出更强的临床治疗潜力。相关工作发表于Nat. Nanotechnol. 2021, 16, 1281、Adv. Mater. 2021, 33, 2008379、Nat. Commun. 2022, 13, 1996。

在本研究中，团队系统性地阐述了PEN光穿孔方法的实施流程，包括静电纺丝法制备PEN基底、细胞与纳米纤维的共培养、PEN光穿孔所需激光平台的构建、光穿孔的影响因素（如NPs浓度、激光功率和扫描时间）以及如何针对特定细胞类型优化该过程。通过这一流程，PEN光穿孔技术成功地将功能性大分子（如CRISPR-Cas9 RNPs和siRNA）传递至难以转染的免疫T细胞中。其中，采用最优光响应纳米纤维递送siRNA至人体免疫T细胞内，抑制PD-1蛋白的表达，并在肿瘤小鼠模型中显著提高了CAR-T细胞的肿瘤细胞杀伤效率。该研究为PEN光穿孔技术在免疫细胞工程化改造中的应用提供了详细的方案，推动了该技术在免疫细胞高效、安全工程化改造中的广泛应用。