第一作者说+Plus深读复旦大学表观遗传实验揭示RNA m6A的新调控机制----Zc3h13

N ⁶ -甲基腺嘌呤（m ⁶ A）是真核生物mRNA上发生最为广泛的甲基化修饰，参与调控mRNA稳定性、剪接加工、转运以及翻译等一系列mRNA代谢过程，在胚胎发育、生长分化以及疾病发生等一系列生命过程中具有重要作用，是近年来表观转录组学的研究热点之一。（超链接： RNA修饰的口述历史 ）

RNA上的m ⁶ A修饰是动态可逆的，由甲基转移酶复合物METTL3/METTL14/WTAP催化形成 ^[1] ，其中METTL3能结合SAM并催化m ⁶ A的形成，METTL14主要提供结合底物的平台 ^{[2, 3]} ，而WTAP则负责将METTL3/METTL14复合物招募到细胞核内的核小斑处以行使甲基化催化功能 ^[4] 。

m ⁶ A修饰在mRNA上的非对称分布、对GGACU基序的偏好、以及其分布的组织特异性和发育阶段的特异性，都提示了可能有更多的蛋白参与了对m ⁶ A修饰的调控。从核心复合物METTL3/METTL14/WTAP的蛋白复合物成员入手，KIAA1429（VIRILIZER/VIRMA）、ZNF217、RBM15、HAKAI等蛋白相继被发现也可以调节m ⁶ A的动态水平 ^[5-8] 。

2015年，Wan et al.在后生动物中通过高通量质谱鉴定，发现ZC3H13-WTAP-VIRILIZER-HAKAI形成一个进化上保守的大分子复合物 ^[9] 。由于WTAP、VIRILIZER、HAKAI都被报道与m ⁶ A的水平相关，那么ZC3H13是否也参与了对RNA m ⁶ A修饰的调控？它在复合物中又扮演了怎样的角色？

在我们的研究中， 我们发现Zc3h13确实是一个重要的RNA m ⁶ A的调控蛋白，与WTAP、Virilizer及Hakai相互作用形成了RNA m ⁶ A修饰的调控复合物。Zc3h13对于将该调控复合物锚定在细胞核中十分关键，并参与调控了小鼠胚胎干细胞的自我更新。

以下是我们详细的实验过程

我们首先在mES细胞中通过co-IP实验验证了Zc3h13能与WTAP、Virilizer、Hakai相互作用（图1A, 1B），并且发现Zc3h13的C端片段（aa 901-1729，aa 1461-1729）对其与WTAP、Virilizer和Hakai的相互作用起到主要作用（图1C, 1D）。

图1. Zc3h13与WTAP、Virilizer、Hakai相互作用

与WTAP、Virilizer及Hakai参与m ⁶ A动态调控的报道一致，我们发现在mES细胞中 敲低Zc3h13导致了mRNA上m ⁶ A总体水平显著降低 （图2A）。我们进而通过MeRIP-seq，比较了Zc3h13敲低细胞及对照细胞转录组水平的m ⁶ A甲基化谱图，发现携带m ⁶ A修饰的mRNA具有GGACU的保守基序，与已经报道的m ⁶ A经典保守基序相符（图2B）；敲低Zc3h13后大量m ⁶ A修饰位点上的m6A富集下降（图2C, 2D），并且 下降主要发生在mRNA的3’非翻译区域 （图2E）。进一步的报告基因实验证明了Zc3h13确实能对具有GGACU基序的m ⁶ A位点上甲基化的形成进行调控（图2F, 2G）。

图2. Zc3h13调控mRNA m ⁶ A水平

Zc3h13是如何影响m ⁶ A水平的呢？由于Zc3h13敲低对Mettl3、Mettl14、FTO和ALKBH5的蛋白表达水平没有很大的影响，考虑到Zc3h13、WTAP、Virilizer、Hakai都被报道与核小斑标志蛋白共定位 ^[10] ，我们推测Zc3h13是否可能影响其复合物成员的细胞定位从而调控m ⁶ A。我们分离了细胞质和细胞核，观察到Zc3h13敲低的细胞中WTAP、Virilizer、Hakai蛋白很明显地从细胞核转移到了细胞质，同时伴随Mettl3和Mettl14核内蛋白的减少（3A）。而与之相反，敲低WTAP、Virilizer和Hakai并不能改变Zc3h13的细胞核定位（图3B）。这提示我们 Zc3h13的作用可能是将复合物中的其他成员WTAP、Virilizer、Hakai锚定在细胞核中 。

那么转移到细胞质中的这些蛋白是否还能形成复合物呢？我们通过co-IP实验发现细胞质中的Mettl3/Mettl14/WTAP复合物以及WTAP、Virilizer、Hakai的相互作用依然存在（图3C），那它们还能继续行使对m ⁶ A的调控功能吗？通过进一步的实验我们发现Zc3h13敲低后细胞质和细胞核mRNA的m6A水平都显著下降（图3D, 3E）；而且两个组分中富集降低的m ⁶ A位点有很高比例的重合（图3F, 3G）。以上的这些结果提示转移到细胞质中的复合物成员不能有效地协调Mettl3和Mettl14行使对m ⁶ A的催化功能，从而进一步提供证据支持 细胞核对于催化m ⁶ A修饰的形成十分重要 。

图3. Zc3h13调控WTAP、Virilizer、Hakai的细胞定位

之前的研究报道Mettl3及Mettl14对m ⁶ A修饰的调控对小鼠胚胎干细胞的干性维持极为重要，那么Zc3h13是否也有类似的表型呢？我们发现敲低Zc3h13后mES细胞形态变得扁平、分散，碱性磷酸酶阳性克隆数目显著减少（图4A-4C），并且经典干性基因表达下调，重要分化基因表达上调（图4G-4I）。这些结果都表明Zc3h13敲低损害了mES细胞的自我更新能力，引起了细胞的分化。

通过进一步的rescue实验，我们发现在Zc3h13敲低细胞中过表达外源的Zc3h13全长或C端片段（aa 901-1729）能显著恢复受损的干细胞自我更新能力及降低的m ⁶ A水平，而过表达N端片段则不能恢复；并且之前的结果表明Zc3h13的C端片段可以与复合物中其他成员相互作用。这提示我们 Zc3h13与WTAP、Virilizer和Hakai间的相互作用对于mRNA上m ⁶ A的形成以及小鼠胚胎干细胞的自我更新潜能十分重要 （图4D-4F）。

此外，我们发现与Zc3h13类似，mES细胞中敲低WTAP、Virilizer或Hakai，也会损害mES细胞的自我更新潜能（图4J-4M）。

图4. Zc3h13影响小鼠胚胎干细胞的自我更新潜能

图5. Zc3h13特异性调控RNA m6A的工作模型图

Cell Discovery近期发表了浙江大学刘建钊课题组对m ⁶ A调控蛋白VIRMA（VIRILIZER/KIAA1429）的研究工作 ^[11] 。研究者通过蛋白组学的方法，发现METTL3/METTL14/WTAP/VIRMA/HAKAI/ZC3H13是甲基转移酶复合物最核心的成员，VIRMA特异性调控mRNA 3’非编码区和近终止密码子区域的m ⁶ A修饰水平。研究者通过生化实验发现VIRMA招募甲基转移酶催化核心METTL3/METTL14/WTAP，从而实现mRNA上特异位点m ⁶ A水平的调控，并且m ⁶ A的修饰与其选择性添加poly(A)尾之间存在调控的关系。

综合以上的这两项研究，为深入研究m ⁶ A修饰的精细调控网络以及选择性调控机制奠定了基础；同时也为m ⁶ A修饰的生物学功能及其对mRNA代谢的影响提供了进一步的证据和线索。

[1]   LIU J, YUE Y, HAN D, et al. A METTL3-METTL14 complex mediates mammalian nuclear RNA N6-adenosine methylation [J]. Nature chemical biology, 2014, 10(2): 93-5.

[2]   WANG P, DOXTADER K A, NAM Y. Structural Basis for Cooperative Function of Mettl3 and Mettl14 Methyltransferases [J]. Molecular cell, 2016, 63(2): 306-17.

[3]   WANG X, FENG J, XUE Y, et al. Structural basis of N(6)-adenosine methylation by the METTL3-METTL14 complex [J]. Nature, 2016, 534(7608): 575-8.

[4]   PING X L, SUN B F, WANG L, et al. Mammalian WTAP is a regulatory subunit of the RNA N6-methyladenosine methyltransferase [J]. Cell research, 2014, 24(2): 177-89.

[5]   SCHWARTZ S, MUMBACH M R, JOVANOVIC M, et al. Perturbation of m6A writers reveals two distinct classes of mRNA methylation at internal and 5' sites [J]. Cell reports, 2014, 8(1): 284-96.

[6]   AGUILO F, ZHANG F, SANCHO A, et al. Coordination of m(6)A mRNA Methylation and Gene Transcription by ZFP217 Regulates Pluripotency and Reprogramming [J]. Cell stem cell, 2015, 17(6): 689-704.

[7]   PATIL D P, CHEN C K, PICKERING B F, et al. m(6)A RNA methylation promotes XIST-mediated transcriptional repression [J]. Nature, 2016, 537(7620): 369-73.

[8]   RUZICKA K, ZHANG M, CAMPILHO A, et al. Identification of factors required for m6 A mRNA methylation in Arabidopsis reveals a role for the conserved E3 ubiquitin ligase HAKAI [J]. New Phytol, 2017, 215(1): 157-72.

[9]   WAN C, BORGESON B, PHANSE S, et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes [J]. Nature, 2015, 525(7569): 339-44.

[10]  HORIUCHI K, KAWAMURA T, IWANARI H, et al. Identification of Wilms' tumor 1-associating protein complex and its role in alternative splicing and the cell cycle [J]. The Journal of biological chemistry, 2013, 288(46): 33292-302.

[11]  YUE Y, LIU J, CUI X, et al. VIRMA mediates preferential m(6)A mRNA methylation in 3'UTR and near stop codon and associates with alternative polyadenylation [J]. Cell discovery, 2018, 4(10.