激光扫描共聚焦显微镜以激光束作光源，通过照明针孔，对标本焦平面上每一点进行扫描，逐点激发样品内荧光，该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡（照明针孔与探测针孔对被探测点是共轭的，所以被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面）有效抑制了非聚焦平面的杂散光，相比于普通的荧光显微镜，其分辨率和清晰度都显著提高。
本文以蔡司LSM980为例介绍激光共聚焦显微镜的使用方法。
（1）打开main switch，水平状态为off，垂直状态为on；
（2）打开Laser（转动钥匙），水平状态为off，垂直状态为on；
（4）若需要在物镜下面观察荧光分布，打开金属卤化灯（注意30分钟之内不要反复开关）；
（5）打开电脑注意，启动软件，选择ZEN system（若关机则按照反向顺序操作）。
（1）上样：向后推起显微镜镜筒，倒扣放上已装好样品的载玻片，复位显微镜镜筒（镜筒一定要复位完全，否则激光器不发射激光）；
（2）在显微镜右侧的显示屏上，选择需要的物镜和模式（明场TL和荧光RL）：
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RL开启，在明确样品位置已经进入视野后，利用卤化灯激发荧光，观察荧光分布。
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物镜：其中2.5x，10x，20x为空气镜，选择该物镜后即可直接观察；40x为水镜，需要以水作为介质观察；60x，100x为油镜，需要以油为介质进行观察（使用镜油后一定要清洁镜头，防止污染其他镜头）。
（3）软件连接后点击Locate，选择相应的激发模块，即可在目镜下观察样品荧光状态 ；
（4）当目镜下确定准确的样品位置后，点击Acquisition，选择smart setup设置通道数量和激发模块；
（5）在smart setup中点击“+”添加通道，根据样品荧光性质选择相应的通道（此处以GFP为例）；
（6）若选择两个通道，需要选择Best Signal模式，此模式下信号强度和扫描速度均为最佳：
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Faster模式：两通道同时扫描，可能出现串色。若样品信号弱，荧光易淬灭可以选择该模式，激光照射时间短，扫描速度较快。
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Best Signal模式：该模式下，两个通道依此进行扫描，不会出现串色情况，适用于信号强，不易淬灭或淬灭较少的样品。
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Smartest模式：两通道时，扫描情况同Best Signal模式，但是在扫描过程中无法调节参数，若设置3通道时，则先扫描中间通道，再同时扫描两端通道。
（7）在Acquisition中选择image setup，调节通道参数 ：
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吸收范围：最大吸收值+20-30（若峰宽则吸收范围大，反之则小），根据样品表达情况调节吸收范围。
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添加明场模式：在任一通道下方点击T-PMP即可添加明场模式（通常是在第一通道上添加）。
（8）在Acquisition mode中可以设置扫描参数（要在开始扫描前设置好，若开始扫描后需要重新调节，需要先停止扫描）；
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Scan Area：设置扫描范围，也可以调节图像角度；
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Frame size：设置分辨率，通常选择1024*1024，分辨率越高扫描时间越长，长时间激光照射，容易损伤样品；
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Averaging：可以提高图像清晰度，但数值越大，扫描时间越长，速度越慢，越容易损失样品。
（9）点击
开始扫描，可以根据图像状态，在channel中调节通道参数：数值越大，信号越强，但会过曝，其中荧光强度（GFP master gain）小于800，明场强度（T-PMP master gain）小于300；
（10）调节完毕后，点击
照相，点击软件右侧图像列表下方保存按钮，保存图片。
按照开机顺序反向操作即可，注意卤化灯不要在30分钟之内反复开光。
本文作者是"花筱福"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。
文稿：花筱福
校对：煲仔饭
素材：
