纳米孔测序技术是一种基于单分子实时分析的先进测序方法，通过监测核酸或多肽分子通过纳米孔时电流信号的变化获取其序列信息。该技术无需扩增或标记，能够快速地读取长链核酸分子序列，广泛应用于基因组学研究和临床。然而，待测分子在通过纳米孔时的二级结构变化会显著影响测序电流信号的稳定性和准确性。同时，现有实验手段难以实时获取分子过孔过程中的构象变化信息。分子动力学模拟为研究这一过程提供了有效工具。全原子分子动力学模拟能够较为准确地预测核酸或多肽的二级结构，但受限于其时间尺度较短（仅上百纳秒），无法完整描述长时间尺度的过孔行为（超过百微秒乃至上千微秒）。粗粒化分子动力学模拟方法虽然在时间尺度上具有优势，但此前没有相关模拟工作实现带有二级结构的生物分子通过蛋白质纳米孔。其原因是蛋白质纳米孔内部电场分布复杂。综上，目前的分子动力学模拟方法在同时实现生物分子二级结构的精确描述和过孔过程的长时间尺度模拟方面仍存在挑战。近日，美国马萨诸塞大学阿默斯特分校（University of Massachusetts Amherst）的Murugappan Muthukumar教授研究组，创新性地结合Poisson-Nernst-Planck方程数值计算，开发了一种兼顾长时间尺度和RNA二级结构描述的分子动力学模拟方法。该方法成功揭示了RNA在通过三种常见的蛋白质纳米孔（α-HL、CsgG和MspA）过程中的二级结构演变机制，并实现了测序电流与分子构象之间的实时关联。相关研究成果发表在《美国化学会志》（J. Am. Chem. Soc.，https://doi.org/10.1021/jacs.4c10640），论文第一作者为李明伦博士。1.研究发现，RNA的过孔过程可以分为三个阶段：假结形成（pseudoknot）、碱基对破裂（melting）和“线团球”状态（molten globule）。这一发现为实验中由二级结构导致的电流大幅波动现象提供了精确的分子机制。2.研究揭示了快和慢两种过孔模式。快模式由电场强度主导，转运速率与纳米孔的几何特性无关；而在慢模式中，“线团球”状态是决定过孔速率的关键因素。并且，RNA“线团球”状态在三个所研究的纳米孔情景下均被发现，说明该构象具有普适性。进一步计算结果表明，“线团球”状态的产生是来自于蛋白质纳米孔内的非均匀空间电场，而非纳米孔的几何特征所致。3.基于上述发现，团队提出了一种神经网络框架，能够通过测序电流信号窗口识别并重构RNA的二级结构。该研究创新性地结合多尺度建模和机器学习，不仅成功解释了RNA过孔过程中构象变化的分子机制，而且还为设计新型纳米孔提供了理论指导，为带有二级结构的生物分子过孔输运动力学研究提供了重要参考和启发。通过调整纳米孔内的电场分布，可进一步优化RNA测序或分子识别的电流信号质量，该研究对高分子和生物分子实时成像技术的开发具有深远意义。图1 RNA分子的初始构象和三种蛋白质纳米孔内部电势分布图2 RNA在过蛋白质纳米孔过程中的三阶段示意图和对应的电流特征
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