多组学及转基因技术揭示UV-B辐射通过激活SmNAC1表达促进单酚酸的合成
期刊：
the plant journal
发表时间：
2020.08
IF：
6.141
2020年8月，以中国药科大学为第一单位的尹小建团队在The Plant Journal上在线发表题为“
Integrative omic and transgenic analyses reveal the positive effect of ultraviolet-B irradiation on salvianolic acid biosynthesis through up-regulation of SmNAC1
”的论文。该文章通过
代谢组学、蛋白质组学与转录组学
多组学结合的方法揭示了UV-B辐射通过激活转录因子SmNAC1表达正向促进丹酚酸生物合成的分子机制。
丹参在心血管疾病中起着重要的治疗作用，并在中国传统医学实践中广为人知。在临床研究中，包括迷迭香酸和丹酚酸（SalAs）在内的酚酸是用于治疗脑血管疾病的丹参制剂的主要亲水生物活性成分。SalAs的市场需求由于其作为处方复方丹参滴丸的应用增加而逐渐增加。
因此，通过从模式植物获得生物合成通路相关基因或体外过表达转录因子(TFs)编码基因，可以增加SalAs的产量
。几种MYB型和MYC型TF，通过调节生物合成酶在丹参中酚酸的生物合成中起重要作用。据报道，包括茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）在内的多种引发剂会增加丹参中植物SalAs的积累。UV-B作为胁迫源和剂量依赖性调节剂会影响植物的生长发育。已经有报道UV-B辐射的丹参中SalA含量的变化，但尚未阐明引起该现象的潜在机制。本文中，采用整合的代谢组学，蛋白质组学和转录组学方法以及转基因分析来剖析UV-B辐射诱导的SalA生物合成的机制。
丹酚酸B常用于评估丹参的质量。为了选择适合丹参的UV-B辐射条件，在300uW/cm2的推荐剂量下，在UV-B辐射（4 h）和（16 h）之后分析了植物的表型和丹酚酸B的含量。UV-B处理4 h后正常生长，16 h后几乎死亡（图1a）。丹酚酸B在UV-B照射4 h后高度增加，处理16 h时略有增加（图1a）。因此，选择了UV-B辐射0（对照）和4h（UV-B处理）的丹参，进行进一步的生理，生化和分子研究（图1b）。
2. 代谢组学分析
：测UV-B照射下丹参中SalA的含量
对UV-B辐射0（对照）和4 h丹参的叶子和根系进行代谢组学分析（图1b）。代谢组学的结果表明，UV-B辐射的叶或根获得的总离子色谱图与对照样品显著不同。在UV-B处理后的丹参叶片和根中分别鉴定出38个和18个差异代谢物(图2a)。通过本实验室构建的SalA文库和已发表的文献进一步分析，发现丹参叶片和根中增加了12个和9个SalAs(图2a);更具体地说，UV-B照射下丹参酚酸B、迷迭香酸和丹参素等主要SalAs在丹参叶片和根中的含量显著升高(图2b)。13(S)-氢过氧亚油酸[13(S)-HpOTrE]、茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)，它们在SalA生物合成中已经被验证发挥了重要作用，在叶片中也显著变化。
图2. UV-B处理对丹参叶片和根中SalA含量的影响
3. 蛋白质组学分析
：揭示UV-B处理后SalA生物合成关键酶的变化
在接下来的研究中，通过比较蛋白质组学分析探讨了调节UV-B辐射诱导SalA生物合成的机制。对照和uv -b处理的叶片和根基于iTRAQ蛋白质组学方法进行分析。总的来说,在叶子和根中16830和21120条肽,置信水平为95%,比对到3303和3620个蛋白质(图3)。进一步分析蛋白质组数据，确定在UV-B处理下丹参叶片中SalA生物合成机制。结果显示处理后的丹参叶片中，9种转录因子蛋白水平增加，包括与拟南芥同源的bHLH1, bHLH2, bHLH3, NAC1。叶片检测到JA生物合成相关的脂氧合酶（LOX）和SA生物合成相关的PAL蛋白也显著升高。支持了UV-B促进了JA和SA的积累。根中只有bHLH2和NAC12个TFs显著升高。
图3. 通过蛋白质组学分析，确定在UV-B照射下参与丹参酚酸(SalAs)生物合成的关键蛋白。
4. 蛋白与代谢相关性分析
：鉴定蛋白水平的变化与SalA含量变化的相关性
代谢组中确定了12种SalA在UV-B处理下叶片中含量升高。蛋白质组中，与SalA生物合成，转录调控，蛋白质稳态，光合作用，叶绿素合成和蔗糖代谢有关的蛋白质受到UV-B辐射的显著影响。然后进行相关分析，以系统的方式评估SalAs水平变化和UV-B响应蛋白之间的关系。如图4所示，根据与SalA含量的相关性值，将显着变化的蛋白质分为三个簇。丹酚酸B和迷迭香酸的水平与簇II中的蛋白质呈正相关，例如SalA生物合成相关的蛋白质和TF。但是，它们与位于簇I中的蛋白质负相关，包括与光合作用相关的蛋白质。（图4）对在UV-B辐射下SalA生物合成的关键基因进行了qpcr验证，
证明了UV-B辐射下的丹参叶片蛋白质组数据与基因表达数据之间具有良好的相关性。
图4. 差异表达蛋白与差异变化丹酚酸(SalAs)的相关性分析
5. 转基因实验
：验证NAC1在SalAs生物合成中的作用
通过分析发现NAC1在丹参叶片中上调最高，表明NAC1可能在UV-B处理下在SalA生物合成中起关键调节作用。为了证明这一假设，用带有Flag标签的NAC1过表达质粒的农杆菌(NAC1-OE)，有绿色荧光蛋白（GFP）的NAC1-RNAi质粒（NAC1-SI）的农杆菌过表达和沉默NAC1基因。通过PCR确认了NAC1-OE质粒在毛状根中的存在，而通过检测GFP信号验证了NAC1-SI质粒在毛状根中的存在（图5a）。RT-qPCR结果还显示，NAC1基因在丹参毛状根中成功过表达或被抑制(图5b)。此外，还使用抗-Flag一抗通过蛋白质印迹法验证了NAC1蛋白水平的增加（图5c）。
图5. NAC1基因的过表达或沉默都会影响丹参毛状根中丹参酚酸生物合成相关基因的表达
为了确定NAC1调控的基因，对NAC1-OE，NAC1-SI和对照系的毛状根进行了比较转录组分析。结果，SalA生物合成相关基因，包括转transketolase-2, enolase, PAL3, TAT3 和 4CL3，在NAC1-OE毛状根中上调，而在NAC1-SI毛状根中下调。PAC2的表达在NAC1-OE毛状根中高度上调，而在NAC1-SI毛状根中无显着变化。通过RT-qPCR评估了转基因毛状根中几种与SalA生物合成相关的基因的表达水平。与预期结果一致，TAT3，PAL3，HPPR3和enolase 基因分别在NAC1-OE和NAC1-SI中过表达和抑制。Transketolase-2和C4H2在NAC1-SI毛状根中显着下调，但在NAC1-OE根中未改变。相反，DPS在NAC1-OE毛状根中显着上调，但在NAC1-SI的根中相对不变（图6）。聚类分析进一步证实了SalA生物合成相关基因的表达水平的变化和编码蛋白水平的变化显示出相似的趋势。与基因表达和酶活性数据一致，在NAC1-OE中丹酚酸B和迷迭香酸的含量高度增加，而在NAC1-SI毛状根中则急剧减少。在这项研究中，选择PAL3而不是PAL2作为NAC1潜在的靶基因，因为PAL3的FPKM表达量为278.67显著高于FPKM为2.0的PAL2。同时，PAL3在NAC1-OE品系中得到增强，而在NAC1-SI品系中受到抑制。在NAC1-OE品系中，PAL2的变化确实非常高，但在NAC1-SI品系中其表达并未受到抑制。此外，在PAL3启动子中有一个CATGTG结合位点，在TAT3启动子中有一个CATGTC结合位点，而在PAL2的启动子序列中没有CATGTG结合位点。ChIP-qPCR分析表明，NAC1可以直接结合PAL3和TAT3基因启动子区域中出现的CATGTG结合位点（图6）。Dual-LUC分析进一步显示NAC1激活了PAL3和TAT3的启动子（图6）。这些结果表明这两个基因是由转录因子NAC1调节的直接下游靶标。
图7.NAC1过表达或沉默对丹参酚酸B和迷迭香酸含量的影响讨论
丹参中的一组次级代谢产物丹酚酸（SalAs）被广泛用于治疗脑血管疾病，它们的生物合成受到多种非生物因素的调节，包括UV-B辐射。但是，目前UV-B辐射对单酚酸含量积累的机制仍然未知。
研究内容：
采用整合的代谢组学，蛋白质组学和转录组学方法以及转基因分析来剖析UV-B辐射诱导的SalA生物合成的机制。代谢组学的结果显示，经UV-B处理丹参叶片中28种代谢物（包括12种SalAs）升高。蛋白质组学分析所示，SalA生物合成中涉及的20种核心生物合成酶和许多转录因子均升高。相关性和基因表达分析表明，编码NAC转录因子的NAC1基因正参与UV-B诱导的SalA生物合成。因此，NAC1的过表达和RNA干扰通过调节关键的生物合成酶分别增加和减少了SalA含量。此外，ChIP-qPCR和Dual-LUC分析表明，NAC1可以直接与SalA生物合成相关的PAL3和TAT3基因启动子中的CATATG和CATGTC基序直接结合，并激活它们的表达。我们的结果共同证明，NAC1在UV-B辐射诱导的SalA生物合成中起关键作用。
迈维小结：
通过转录组，蛋白质组，代谢组的分析，确定UV-B处理后单酚酸合成的调控基因，其中多组学的关联分析在数据筛选中起到了积极作用。挑选的候选基因后，利用chip-seq进行了候选基因的验证，升华了文章水平。
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