蜱虫怎么牢牢吸附？揭秘“神奇蛋白”的液态粘附术

生物粘附剂广泛存在于自然界，多种生物利用其进行附着、捕猎和防御。然而，许多粘附剂的机制尚未明确，蜱分泌的“水泥锥”便是其中之一。硬蜱通过甘氨酸丰富蛋白（GRPs）强化附着并实现长时间吸血，这一过程与疾病传播密切相关。尽管GRPs被认为提供了水泥锥的强度和稳定性，其具体机制仍未解明。

2024年11月29日， 瓦赫宁根大学的Siddharth Deshpande和马斯特里赫特大学的Ingrid Dijkgraaf团队在Nature Chemistry期刊上发表了一篇名为：Phase separation and ageing of glycine-rich protein from tick adhesive的论文。

蜱唾液中甘氨酸丰富蛋白（GRP）的氨基酸序列分析及其结构特征

GRP包含19个氨基酸的信号肽，负责其转运，剩余77个氨基酸构成成熟的tick-GRP77序列。该蛋白约26%为甘氨酸，其他主要为非极性（44%）和极性（36%）氨基酸，少量为疏水性和芳香性残基。AlphaFold预测表明，信号肽呈α螺旋结构，而成熟蛋白则缺乏明显的二级结构。IUPred算法和其他预测工具确认tick-GRP77为高度无序蛋白（IDP），这一特征支持其可能参与液–液相分离（LLPS）。

图1：蜱唾液中富含甘氨酸的蛋白质是天然无序的，并且具有很高的LLPS倾向性。

蜱GRP77通过蒸发诱导的液–液相分离（LLPS）行为

实验中，将2μl含GRP77的溶液滴加到亲水玻璃表面，随着蒸发，蛋白质在液滴边界积聚，形成凝聚体。在32μM浓度下，随着时间推移，液滴边界出现明显的相分界，并形成微米级的GRP77凝聚体。增加初始浓度加速了凝聚体的形成。进一步验证表明，盐的存在促进了GRP77的相分离，而水溶液和牛血清白蛋白未能形成凝聚体。凝聚体之间出现融合现象，表现出液态特性，且这一过程是可逆的。实验结果表明，GRP77通过简单的共沉淀过程形成粘性液滴。

图2：Tick-GRP77通过简单的共沉淀发生LLPS，形成类似液体的凝聚体。

蜱GRP77不同氨基酸序列对液–液相分离（LLPS）的影响

通过比较GRP77的N末端（20–51）和C末端（52–96），发现C末端富含碱性氨基酸和芳香族氨基酸，能更快地引发相分离，并且倾向于润湿玻璃表面。通过突变实验，去除芳香族氨基酸（ΔFY突变体）或精氨酸（ΔR突变体）后，LLPS现象显著减弱，说明芳香族氨基酸和精氨酸在驱动相分离中的重要作用。此外，氢键和疏水相互作用也在共沉淀过程中发挥作用，尿素和1,6-己二醇能够有效干扰这些作用。总体而言，精氨酸的c-π和π-π相互作用在LLPS中起主导作用。

图3：精氨酸和芳香族残基是驱动tick-GRP77相分离的关键因素。

磷酸盐对蜱GRP77液–液相分离（LLPS）的促进作用

通过向GRP77溶液中添加氢磷酸钠（Na2HPO4），在不同浓度下快速观察到相分离，尤其是在较高的盐浓度（1 M）和较高的GRP77浓度（63 µM和125 µM）下。低浓度（16 µM）在1.5小时内也能迅速形成凝聚体。模拟蜱唾液拥挤环境，添加聚乙二醇（PEG）后，GRP77在更低的盐浓度下也能立即相分离。进一步通过微流控设备观察，GRP和Na2HPO4的流动交汇处立即形成了蜱GRP77凝聚体，表明盐引发了迅速的液滴形成。

图4：在磷酸盐存在下，tick-GRP77形成凝聚体。

蜱GRP77凝聚体从液态到凝胶态的转变

高浓度GRP77在蒸发实验中形成的凝聚体不仅融合形成网状结构，还展现了粘附性和黏弹性特征。在盐诱导的共聚集实验中，长时间孵育的高浓度GRP77凝聚体表现出稳定的簇状结构，且通过荧光恢复实验（FRAP）观察到，随着时间推移，凝聚体的流动性显著减弱，表明它们从液态转变为固态。新鲜样本的荧光恢复较快（约49%），而陈旧样本恢复极慢（约2%）。此外，蜱GRP77凝聚体具有极高的粘附性，表现出强大的附着力。

图5：GRP凝聚体形成粘弹性网络和固态聚集体，并表现出粘附特性。

自然蜱唾液中蛋白质凝聚体的证据

通过从自然栖息地收集蜱并提取其唾液腺内容物，发现蜱唾液中存在多种蛋白质（10–100 kDa）。显微镜观察发现，唾液腺提取物中有多个微米级的球形液滴，并记录到液滴融合现象，表明其液态特性。高盐浓度处理后，还观察到纤维状结构，且荧光标记的GRP77蛋白在这些液滴/纤维中有强烈的分配。进一步分析表明，蜱唾液中可能普遍存在GRP富集的凝聚体，而不仅仅是tick-GRP77。多种蜱GRPs的氨基酸组成与tick-GRP77相似，表明该凝聚体机制可能是蜱唾液中蛋白质过渡的普遍路径。

图6：蜱的唾液腺提取物暗示存在富含蛋白质的相分离液滴。

小结

本研究表明，蜱唾液中的富甘氨酸蛋白（GRP）通过简单的共沉淀发生LLPS，并在数小时内表现出老化行为，形成类似凝胶的粘附结构，可能在蜱的粘附过程（如水泥锥形成）中发挥重要作用。GRP中的精氨酸和芳香族残基通过阳离子-π和π-π相互作用驱动LLPS。类似的液-固转变过程在其他生物的粘附剂中也有发现，揭示了生物粘附蛋白的共性。GRP的研究可能为生物粘合剂、抗蜱疫苗以及药物递送系统的发展提供新思路，并有助于控制蜱传播的疾病。