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肠道菌群与人类健康的密切关系越来越受到重视，已经成为时下最热门的研究方向之一。被称为人类“第二基因组”的肠道菌群除了受到环境、饮食、疾病等因素的影响以外，还在一定程度上受到遗传因素影响，也就是说肠道微生物会受到宿主基因的控制。
那么一篇肠道菌群的GWAS研究如何做怎样才能发到高水平的期刊呢？今天就以2016年发表在Nature Genetics上的一篇文章为例，讲讲高水平的肠道菌群的GWAS研究思路是怎样的。
题目：Genome-wide association analysis identifies variation in vitamin D receptor and other host factors influencing the gut microbiota
期刊：Nature Genetics
发表时间：2016年10月
本文主要利用1812人的样本集进行GWAS研究，发现了一系列影响肠道菌群的SNP。之后针对VDR基因上的SNP为例，研究了该基因影响肠道微生物的机制。
大致可以把这篇文章的思路分为三步：
下面我们看看作者如何一步步有理有据地走下来。
协变量：经过相关性分析确定了年龄，性别，吸烟，饮食等情况对于肠道微生物的影响都是显著的（图1），因此都被纳入关联分析作为协变量。
微生物筛选：通过对于10个样本做三次测序的技术重复，并计算两两重复之间的相关性。发现reads大于40时技术重复的相关性r2达到0.97（图2），因此将低于40的分类单位都去除了。最终剩下58个分类单元（core measurable microbiota）用于关联分析。
人群分层：根据计算总体的λGC = 1.00，因此没有人群分层（图3）。后面关联分析时还是将遗传的前3个主成分作为了协变量进行了校正。
样本: n=1812（FoCus + PopGen）
微生物数据: 58个分类单元和40个 40 species-level OTUs.
SNP处理: MAF >0.05 , IMPUTE2 INFO criteria >0.8.
模型: 负二项分布模型.
协变量: BMI, 年龄,性别,遗传主成分1-3, 饮食因素
结果：找到40个与单个微生物显著关联的位点，对于22个bacteria；42个与 β-diversity 显著关联的位点，其中21个在独立的肥胖样本中验证。（图4）
接下来，作者只选了一个位点rs7974353以及其对于的基因—VDR。这个位点并不是两个关联分析的交集，只在β-diversity关联分析中是显著的，但也并不是top显著的位点。
VDR基因是Vitamin D受体基因，而在第一组关联分析后的富集分析结果在出现了response to vitamin 以及 response to vitamin D response to vitamin A等关键词（图5），而且P值非常显著。提示该基因可能与β-diversity以及某些微生物关联。且根据文献查询结果，该基因的产物会形成VDR-RXR二聚体，VD、微生物的次级代谢产物 secondary bile acid 等都可以作为配体与之结合从而发挥功能（图6）。因此作者后面选择该基因作为研究对象。
在VDR基因敲除小鼠中证明了VDR基因确实会影响肠道菌群的β-多样性（图7）。同时还发现敲除后的小鼠 Parabacteroides 显著上升（图8），因此VDR与 Parabacteroides 呈负相关。
59个结肠活检样本（case/control），疾病组中VDR上调，相应的 Parabacteroides 下调，呈负相关，与小鼠实验中一致。此外在该实验中，还发现bile acid代谢相关基因的表达与 Parabacteroides 的丰富显著相关（图9）。因此提出VDR基因通过影响bile acid代谢来影响肠道微生物（例如 Parabacteroides）。下面，就要验证虚线的关系是否成立。
为了验证bile acid是否与肠道菌群相关，作者取了551个样本检测了血清中的5中bile acid 和fatty acid含量，然后与肠道菌群做相关性分析。发现多数bile acid确实与肠道菌群显著关联，其中bile acid 与 Parabacteroides 的相关性也是显著的（图10）。
为了验证VDR与bile acid 代谢的相关性，作者选取了122个样本做了肠道菌群的全宏基因组测序，组装得到基因和通路的丰度，并选出与bile acid代谢相关的基因。发现VDR genotype也显著影响肠道微生物中VDR代谢通路的基因丰度（图11）。
本文通过全基因组关联分析，得到了一系列影响肠道菌群的SNP，通过基因功能筛选确定VDR基因为研究目标。并通过一系列分析找到VDR基因可能通过bile acid代谢影响肠道菌群。最后验证了 "VDR genotype--bile acid代谢—肠道菌群” 这样一个调控通路。
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