这次要讲的文献题目是“抗-miRNA-30b通过增强细胞自噬抑制TNF-α诱导的细胞凋亡和软骨降解”(回复
“0410”
可下载文献，一周有效)
最近好多地方都在讲怎么速读文献，那就凑个热闹，借这篇文章顺道说下个人浏览习惯：
①看Title和Keywords确定要不要浏览；
②看图和图下注释，了解文章做了什么怎么做的，进一步确定要不要精读；
③从头精读。不是写文章的情况下，前言和讨论通常是不看的。
所以，摘要我也是不看的。。。。。。
TNF-α是一种诱导细胞凋亡的炎性细胞因子，TNF-α诱导ATDC5细胞系活力降低，凋亡增加。即TNF-α处理细胞，建立细胞模型。
Fig.1(A)
CCK-8试剂盒检测细胞活力，较高浓度TNF-α(10ng/mL或者20ng/mL在12、24、48小时细胞活力显著降低)。
Fig.1(B)
用Hoechst 33342染色进一步证实高浓度TNF-α下活细胞数量显著减少，在TNF-α处理的细胞中观察到染色质凝聚、断裂等细胞凋亡特征。
Fig.1(C、D）
20ng/ml TNF-α处理，WB检测细胞凋亡指标caspase 3和caspase 9的表达量上调。
TNF-α诱导ATDC5细胞的自噬变化（建立模型）
Fig.2(A)
将GFP-LC3B表达质粒转染细胞，并用TNF-α、Rap（自噬活化剂）或3-MA（抑制剂自噬）处理。与对照组相比，Rap活化剂组：GFP标记斑点显示的自噬体形成数量显着增加；3-MA抑制剂组自噬体数量显著降低，证明GFP标记质粒转染法的有效性。TNF-α组自噬体数量增加，表明TNF-α对细胞自噬具有正向调节作用（即细胞模型成功建立）。
LC3是细胞自噬泡膜通用标记物，构建LC3蛋白与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，当自噬发生时，在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光。
Fig.2(B)
蛋白质印迹法分析四组自噬相关蛋白BECN1、ATG5、LC3B-II和p62的表达。与对照组比，TNF-α组自噬基因BECN1、ATG5、LC3B-II表达上调，p62表达下调。证明TNF-α对ATDC5细胞自噬具有正调节作用（细胞模型成功建立）。
miRNA-30b直接作用于BECN1和ATG5
Fig.3（A）
在BECN1和ATG5 mRNA的3'-UTR区域内推定miRNA-30b的结合位点。扩增含有miRNA-30b结合位点的片段，并将其构建到pGL3质粒中；将结合位点突变，构建质粒。分别构建：BECN1-WT、ATG5-WT、BECN1-mut（突变）、ATG5-mut（突变）。转染入ATDC5细胞，测定荧光强度。
Fig.3（B）
miR-30b与BECN1-WT组荧光强度显著降低，说明miR-30b与BECN1有结合使BECN1表达降低。miR-30b与ATG5-WT组荧光强度显著降低，说明miR-30b与ATG5有结合使ATG5表达降低。
Fig.3（C）
用miR-NC、miR-30b、antimiR-NC和antimiR-30b转染细胞，RT-PCR分析BECN1和ATG5的mRNA表达水平，在miR-30b存在条件下BECN1和ATG5表达降低。
Fig.3（D）
蛋白质印迹分析在蛋白水平显示出了类似结果。以上结果表明miR-30b具有调节自噬基因表达的作用。
miR-30b下调TNF-α诱导的自噬和ATDC5细胞中自噬基因的表达（miR-30b对细胞模型的自噬调节）
用GFP-LC3B质粒转染模型细胞，检测荧光自噬体数量。
Fig.4(A)
miR-30b组自噬体形成显著减少；抗-miR-30b组自噬体形成显著增多。
Fig.4(B)
蛋白质印迹分析：抗-miR-30b上调自噬基因LC3-II的表达，下调P62降解蛋白的表达，与miR-30b作用正好相反。miR-30b下调了细胞模型的自噬作用。
