Cell精读 | 榕树和授粉榕小蜂基因组为榕蜂协同进化提供见解

榕树和授粉榕小蜂基因组为榕蜂协同进化提供见解

1、榕树通过吸引和支持许多不同物种的种子传播者，成为热带森林恢复的关键组成部分。榕属植物具有几个特殊特征，包括封闭的花序、榕蜂专性共生关系、性别决定系统以及一些具有半表生习性的物种。

2、榕树及专为其授粉的榕小蜂物种是研究生态学和进化基本现象的模型系统，包括合作、共同进化、生态网络、共同多样化和对气候变化的响应。

3、 F. microcarpa（Fm） 和 F. hispida（Fh） 代表榕树的两个不同的生殖系统：雌雄异株和功能雌雄同株；以及不同的生长形式：即半表生和陆地生长。

4、榕树作为研究植物-昆虫互作的理想模型系统的重要组成部分，高质量基因组有助于发现其特殊特征背后的遗传机制，包括气生根发育、性别确定、起源和进化，以及其与授粉榕小蜂的共生多样化。

Fm和Fh代表两个不同的生殖系统并携带不同数量的染色体：Fm中的13对和F. hispida中的14对。根据流式细胞术估计Fm基因组大小436 Mb，F. hispida 为370 Mb，这与K-mer计数的结果一致。Fm和Fh基因组注释分别得到29,416和27,211个蛋白编码基因，BUSCO评估完整性分别为94.4%和95.7%。这两个榕属基因组的比较显示保守同义区块中有17052个基因对匹配被认为是直系同源对。通过整合来自多个物种的直系同源基因并分析了它们的系统发生关系，可以估计这两个榕属物种在距今4000万年前就已分化。

通过基因组测序组装和去冗余，最终组装387 Mb 的Fm传粉蜂 E. verticillata 基因组，BUSCO评估完整性达97.7%；共注释了14312个蛋白编码基因。通过对 E. verticillata 和Fh传粉蜂 Ceratosolen solmsi 公布的基因组进行对比分析，两种寄生蜂的变异幅度与Fm和Fh的变异幅度相似。

通过比对Fm和Fh的基因组发现许多结构变异(SVs)。一个融合/裂变事件的发生涉及Fm的3号染色体(FmChr03)及其同源物、Fh的3号和7号染色体 (FhChr03 & FhChr07)，随后在两个染色体片段中各发生两次逆序(图1)，其中FmChr03的同源区域覆盖3.49 Mb涉及200个重叠基因，FhChr03的同源区域覆盖1.34 Mb, FhChr07的同源区域覆盖1.12 Mb，共涉及300个基因。

全基因组比对分析表明, Fm基因组中116.5 Mb(27.5%)覆盖7636个基因和Fh基因组中79.4 Mb(22.1%)包含4920个基因是节段重复(SDs)，约38 Mb的SDs在这两个榕树属基因组之间共享,表明SD对基因组规模扩张是一个主要贡献者。通过转座因子(TEs)注释发现其在Fm中占46.5%，在Fh中占48.9%。在两个榕树基因组中，II类TEs和富基因区域的分布模式相反(图1C)，在Fm和Fh中Spearman等级相关系数分别为-0.78和-0.66。GO功能富集分析显示, FmChr03和FhChr03区域基因功能主要与植物免疫力有关,而在重排于FhChr07区域的植物营养相关基因非常多。Fm的SD区域内重叠的基因在单萜/萜相关的生物学过程中显著富集。

图1. Fm和Fh的基因组特征

(A)染色体分析；(B) SDs；(C)基因密度；(D) LTR TEs；(E) DNA TEs；(F)基因表达；(G)两个基因组间共线性分析。

榕树最显著的特征是其独特的气生根，而一些榕树如Fh则没有气生根。为了研究Fm中诱发气生根的途径，鉴定了811个在气生根根尖高表达的基因，显著富集在一系列运输相关的生物过程中。其中编码生长素外排载体的 PIN1 和生长素基因 GNOM 在气生根中高表达(图2A)，表明生长素的向顶运输是高效的。与生长素生物合成相关的 TAR 和 YUC 基因，以及包括 IAA14 、 ARF7/19 、 PLETHORA2 ( PLT2 )和 WOX11 等转录因子(TFs)的转录本在气生根组织中也更为丰富(图2A)。

通过对PIN家族的系统发育分析发现 PIN1 基因拷贝数存在显著变化(Fm中有4个拷贝，Fh中有2个拷贝， A. thaliana 中有1个拷贝)，并确定了两个进化的 PIN1 亚群(图2C)。RNA-seq分析显示， FmPIN1a 在大多数被测组织样本中表达;而 FmPIN1b1 、 FmPIN1b2 和 FmPIN1b3 在气生根样品中高表达。TAR和YUC基因家族的扩展为增强IAA生物合成提供了基本的遗传物质。光受体CRY2和PHR2拷贝数的增加，以及TAR编码 (如TAT2a、TAT2b和TAT7b)和YUC6编码基因的表达增加，进一步加速了IAA的积累(图2A和2B)。

通过对内生生长素进行定量分析发现Fm气生根(15.65 ng/g)中IAA含量显著高于Fm叶片(3.11 ng/g)和Fh叶片(3.38 ng/g)中的，气生根中IAA含量增加了5倍多(图2D)，表明生长素含量增加触发了气生根的发育。因此认为，光促进的生长素依赖途径与气生根的启动和发育相关 (图2E)。

图2. Fm气生根发育的基因组基础

(A) Fm气生根高表达基因与其他组织的比较；(B) Fm中涉及的关键基因扩增与其他物种的比较；(C) Fm、Fh和 A. thaliana 的PIN基因家族系统发育树；(D) Fh叶片和Fm气生根、叶片中 植物激素含量测定 ；(E)控制气生根启动和发育的生长素依赖途径模型。

通过对60个F1个体(性别比1:1)及其母本进行重测序，构建了超高密度F1父本遗传图谱。在Chr12中，第一个2Mb区域中的一个非重组区域被确定为性别决定区域(SDR)(图3A)，并在SDR中注释到一个MADS box TF (Fh.12G0000020 )。X和Y染色体的比较分析显示存在或缺失变异(PAV)，它包含一个42kb的雄性特异性区域，只存在于雄性个体中。这个42-kb的区域只包含一个蛋白质编码基因( Fh.12G0000020 )，它与位于SDR中的基因相同。

RNA-seq分析显示， Fh.12G0000020 在雄花A期、B期、C期的三个不同阶段均有显著表达。但是，该基因在雌性花序中没有表达，强烈表明该基因是影响性别决定的主要因素（图3E）。将重测序基因组与Fh参考基因组比对， Fh. 12g0000020 基因仅存在于雄性基因组中，而在雌性基因组中缺失(图3D)。系统发育分析显示， Fh.12G0000020 基因是拟南芥 AGAMOUS (AG) 基因的同源物， AGAMOUS (AG) 基因是一个c类MADS box基因，在生殖器官发育中起核心作用。

Fh.01G0006690/FhAG1、Fh.12G0000020/FhAG2、Fh.v50013370/FhAG3 在Fh基因组中鉴定，而在雌雄同株的Fm的基因组中只检测到一个拷贝( Fm. 01g0007740/FmAG )(图3E)。这四种 AG 同源物在编码序列、蛋白序列和基因结构上高度相似。如图3E可见 FmAG 和 FhAG1 在花、叶、根中表达模式非常相似(图3E)，同源基因组区域之间保持着很强的共线性，说明 FhAG1 可能是 AG 在Fh中的祖先拷贝和直系同源物。旁系同源物 FhAG2 和 FhAG3 转录本在雄性花序中表达明显升高(图3E)且仅在雄性植株中表达，提示它们在功能上是重复的，可能是在榕树雌雄异株分化之后重复的。从 FhAG2 基因序列中提取的雄性特异性标记的PCR分析结果显示，在一群雌雄异株榕树亚属中，雄性植株阳性，而雌性植株阴性。 综上， FhAG2 是性别决定的有力候选基因。

图3. Fh的Y染色体和性别决定候选基因的鉴定

(A) Fh雌雄遗传图谱的比较；(D)雌雄个体比对参考基因组发现 Fh.12G0000020 ( FhAG2 )基因存在或缺失变异(PAV)；(E) FmAG 、 FhAG1 、 FhAG2 、 FhAG3 在各时期/组织样本中的表达。

为了研究榕树和榕小蜂之间协同进化的潜在分子机制，使用来自 Sycomorus 属的14个重测序物种和来自其相应授粉媒介（ Ceratosolen spp. ）的355,632个SNP鉴定了228万个高质量SNP。系统发育分析表明，在该分类学水平上，宿主关联具有较强的保守性（图5B）。

为了确定在这些共同进化的物种中可能经历了互惠选择和分化的候选基因，使用Tajima’s D和SweeD分析在榕树和榕小蜂基因组中进行了选择性扫描(图5A)。极端严格的互惠共生系统导致了榕树与榕小蜂之间的协同适应和共散，可能导致相应的表型性状，包括榕小蜂体型和榕树果实大小。为了验证这个假设，在Fh基因组中验证了37个基因并发现18.9%（7/37) 的检测基因在纯化选择，包括3个生长素信号相关基因( ARF7、ARF8 和 TIR1 )，2个脱落酸(ABA) 生物合成基因( NCED 和 FLACCA )，1个基因( SuSy )参与初级代谢，以及1个参与细胞周期控制的基因( CDKA ) (图5A)。同时，榕小蜂Hippo信号通路的62个基因中有14个(22.5%)位于选择性扫描的基因组区域(图5A)。Hippo信号通路通过调节细胞增殖和凋亡来控制动物器官大小，对纯化选择下榕小蜂基因的GO和KEGG分析也揭示了几个参与器官发育和体型大小的基因。

图5. A: Tajima’s D和SweeD分析；B: 榕-蜂物种系统发育分析

提出了榕树与榕小蜂专性共生的一个关键假设，即它们之间的相互作用受到榕树花序中特定挥发性有机化合物成分的严格控制。因此研究了在三对榕-蜂对（Fh-C. solmsi , F. auriculata-C. emarginatus, 和 F. semicordata-C. gravelyi —代表 Sycomorus 亚属主要榕树物种及其授粉蜂）中与通讯至关重要的物种特异性信号化合物。针对B期的活性化合物为Fh中未知的倍半萜酮FHSTN1、FHSTN2、FHSTN3和苯甲酸苄酯; F. auriculata 中未知倍半萜酮FASTN1、FASTN2和FASTN3;和 F. semicordata 中的4-甲基苯胺(图5D)。所有这些化合物可分为两类:甲羟戊酸途径合成的异丙苯衍生物(均为未知倍半萜)和莽草酸途径合成的苯类衍生物(4-甲基苯胺)。电生理学测试结果也支持了甲羟戊酸和莽草酸途径在吸引特定物种授粉媒介中的重要作用。对 Sycomorus 亚属的重测序基因组进行群体基因组分析，验证了甲羟戊酸途径和莽草酸通路涉及的基因进化约束。测试甲羟戊酸途径和莽草酸通路相关基因的结果表明，在包含甲羟戊酸和莽草酸途径基因的基因组区域选择压力促进了榕树亚属 Sycomorus 中特定VOCs的产生和物种多样化（图5C）。

在Fh的传粉者 C. solmsi wasp 基因组中发现了77个介导化学检测的基因。这些基因编码的蛋白质使榕小蜂能够处理嗅觉(Or)和味觉(Gr)线索。在这些基因中，5个编码ORs、1个编码CSPs和1个嗜离子受体(IR)表现出选择性扫描信号(图5C)。在具有化学信号识别基因的基因组区域，选择性压力是造成 Sycomorus 授粉榕小蜂物种分化的主要原因。 影响榕树器官大小和特定挥发性有机化合物产生的基因选择性信号和专性传粉榕小蜂的化学感觉受体为榕树和传粉榕小蜂在形态和生理上的协同适应在它们的共同多样化中起关键作用这一观点提供支持。

图5. C: Tajima’s D和SweeD分析；D: 物种特异性信号化合物

研究结果： 榕属包括已进化出与特定物种-传粉榕小蜂建立共生体系的物种。生长素相关基因拷贝数和生长素产量的增加与 F. microcarpa 的气生根发育有关。雄性特异的 AGAMOUS 同源物 FhAG2 被鉴定为 F. hispida 中的性别决定候选基因。榕属物种的种群基因组分析表明，与它们的传粉媒介有关的形态和生理共适应的基因组特征涉及到活性挥发化合物。综上，榕蜂基因组为研究气生根、雌雄异株和共生系统中的共同多样化提供了新的见解。

迈维小结： 本研究通过高质量基因组的搭建来发现榕树特殊特征背后的遗传机制，包括气生根发育、性别确定、起源和进化，以及其与授粉榕小蜂的共生多样化，并结合表型代谢组学-即通过激素检测和挥发性化合物检测来鲜明有力地印证了气生根发育和榕蜂共生多样化的关键论点，体现了结合代谢组学解释动植物的生长发育、（非）生物胁迫等机制相关的基因组特征时的技术思路。

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