美国，加拿大和欧洲各国对药物生物等效性研究的要求简介

序

前段时间，朋友圈发生了一件趣事。A公司四条曲线对上了，BE过了，老板兴高采烈回来跟员工说，我们运气真好，BE一次过了；B公司四条曲线也对上了，两次BE都没过，老板回来大发雷霆，一个劲抱怨员工水平差。C公司的人听到B公司的事例，不敢轻易BE，一个劲地最求高分辨率的溶出曲线，结果老板说员工的效率太差，水平不行。听到这个事后，小编有些打抱不平了，这说来说去，药学工作者BE成了，没有功劳，BE败了，药学工作者就是替罪羊。

为此药事纵横组织小编翻译了本文，用证据告诉您，BE失败了，临床部门有责任，方案设计者有责任，不要把所有责任都推给药学工作者，不服气的话请问问自己，以下细节你做到了么？

摘要

本文的主旨是解读汇总美国，欧盟及加拿大各国对药品生物等效性研究的注册要求。在药企进行生物等效性研究之前对要进入该国市场的相关指导原则进行研究。这篇文章总结了生物等效性研究中的关键要点如试验设计，禁食或者非禁食研究，志愿者招募，试验剂量，采血点，分析方法验证参数，血浆分析，药代动力学参数，生物等效标准，GCP要求等，这些都是制药企业在进行生物等效性研究申报需要考虑的。另外，还需要考虑供试品及参比制剂等问题。供试品通常是由委托方生产，参比制剂则是由政府机构指定。采血点也根据各国的指导原则不同而不同但是均遵循ICH GCP指导原则。生物等效性标准包括Cmax, AUCt,AUC0– 的90%CI 在80-125%。

简介

由于生物利用度与生物等效性在专利药及仿制药申请中的应用，在过去得30年中获得了相当大的重视。期间， 法规机构 也开始对仿制药的开发和批准制定相应的知道原则及法规。因此，再申报中这些科学概念的评价方法有巨大的调整和更新。BA和BE成为全球范围内专利药和仿制药批准的基础，并且也为专利药开发减少了研发成本。令人鼓舞的是，在国内和国际上，法规机构和科学界均在做不断的努力，去理解和开发更有效率的及科学的方法去评价不同剂型包括一些艰难复杂的特殊剂型的BE方法。由于仿制药在医疗健康中的重要性，因此必须确实地评价仿制药的质量及体内特性。另外由于仿制药将来会替换专利药在市场中的位置，所以应该证实仿制药的安全性和有效性与创新药安全性和有效性的可比性。所以应运用体内等效或者生物等效研究来评价这种“可互换性”。

美国对生物等效性要求

口服药物生物等效性研究注册要求详见21 CFR 320。

1. 1 实验设计

一个随机，平衡，单次，2种处理(非禁食VS禁食)，2个周期，2个交叉设计的实验来研究食物对速释或者缓控释药物的生物利用度的影响。供试品和参比制剂在进食的情况下服用后，经过一个适当的清洗期将两种处理隔开。空腹时(禁食处理)作为一个实验周期，进食是另外一个实验阶段。2种处理，2 个实验周期，2个交叉实验设计为食物影响情况下的生物等效性研究是被推荐的，除非供试品及参比制剂均需要在进食时比较其生物等效性。在食物影响的生物利用度和生物等效性研究中，一个适当的清洗期会将这两种处理分隔开。对速释的固体和混悬制剂，通常进行非-重复，随机，单剂量，2种处理，2个周期，2种交叉的实验设计。

1. 2 样本量和脱落率

在任何一个生物等效性研究中，12个可评估的样本量为最少样本量。当一个生物等效性研究选用非重复或者重复设计时，用合理的实验设计方案来进行样本量的设置。生物等效性研究中的样本量可根据人群也可根据个体的生物等效性方法模拟估计。委托方应该设计合适的样本量来满足可能发生的脱落。因为在实验中替换个体会造成统计和分析的复杂化；而个体脱落通常也不会去补充样本。委托方若需要对脱落的个体进行替换应该在方案中进行描述。方案也应描述是否采用替换者的数据。如果脱落率较高，委托方希望增加样本量，建议对统计方法进行修正。在数据分析完成后，额外的数据则不需要被纳入，除非在实验设计最开始就已规定。

1. 3 食物对生物利用度及生物等效性影响的研究

食物对生物利用度影响的研究通常在新药或者制剂进行IND申请阶段，在餐后立即服用药物或者禁食条件下服用药物时，评价食物对药物吸收速度和程度的影响。另一方面，在申请ANDAs时，食物的生物等效性研究则可描述其与参比制剂在进食条件下的生物等效性问题。

1. 4 食物对生物利用度影响的可能机制

食物可改变药物的生物利用度，能影响供试品和参比制剂的生物等效性。食物对生物利用度的影响能显著改变临床疗效。食物通过不同的方式改变其生物利用度，包括延迟胃排空，刺激胆汁流量，改变胃肠道PH，增加内脏血流量，改变药物的管腔代谢，与药物的物理的或者化学相互作用。

1. 5 研究的注意事项

这一部分提供了在设计食物影响生物利用度及生物等效性研究时的总体考虑。委托方可提出一个可供选择的研究设计和数据分析方案。试验设计和分析的科学性和方法的选择理由应该在研究方案中有描述。委托方可以选择补充额外的实验来更好地理解药物的性质，并且提供剂型的恰当描述和给药方式(例如不同的食物，用餐与用药的不同时间点). 在研究缓控释制剂时，需要考虑与食物共同服用时药物的突释作用，计划的剂量可能比预期更快地从该剂型中迅速释放，造成潜在的安全风险。

1. 6 样本的选择

食物影响的生物利用度和生物等效性试验可以选择18岁以上并且能够签署知情同意书的健康志愿者。如果有安全性的考虑不能使用健康人群则可在病人中开展此研究。另外需要考虑符合统计学的足够的样本数量。

1. 7 剂量设计

总体上，食物影响的生物利用度及生物等效性试验剂量设计应包含药物在日常使用的最高剂量。在某些情况下，基于临床安全性的考虑，将不建议使用最高剂量。为支持ANDAs申请，在禁食和非禁食的生物等效性研究中应使用相同的的批号和规格。对于ANDAs申请中的多种规格的药物来说，如果BE研究已经使用了最高剂量，基于溶解性的对比，则不需要进行一个或者多个较低规格的制剂BE研究。

1. 8 试验餐

我们建议食物影响的BA和BE研究中的试验餐能够对胃肠道产生最大的影响，由此可对药物的系统利用产生最大的影响。在该研究中，建议使用一个高脂肪（大约一餐中含有50%的热量）以及高-卡路里(大约800-1000卡路里)的试验餐。该试验餐能够分别从蛋白质，碳水化合物，脂肪中提供大约150，250，以及500-600的热量。试验餐的热量来源需要在研究报告中体现。如果实验中发现试验餐的热量来源与研究报告中描述不一致，委托方应该对该差异进行科学的解释。在NDAs申请的BA研究中，委托方可以选择含有脂肪，糖类及蛋白质不同配比的试验餐来满足探索目的或者研究目的。然而在食物影响的生物利用度研究中应该使用以上描述的高脂肪，高胆固醇的试验餐。

1. 9 给药

禁食处理组

在至少10个小时的禁食过夜之后，开始给予受试者240ml(8盎司)水送服药物。给药后至少4小时不能进食， 用药前后 1小时禁水。在研究的不同周期同一时间段食用标准试验餐。

非禁食处理组

在至少10个小时的禁食过夜之后，在服药30分钟前，受试者开始进食试验餐。受试者应该在30分钟之内吃完试验餐；进餐开始30分钟后开始服用药物。用240ml(8盎司)水送服药物。在用药后4小时内禁食，用药前后1小时禁水。在研究的不同周期同一时间段食用标准试验餐。

1. 10 样本采集

对禁食及非禁食的实验周期中，通常采集的血浆标本的各时间点应满足描述母体药物的血浆浓度-时间的PK特性。委托方也可参考口服药物的生物利用度和生物等效性研究的指导原则中关于测定血浆中其它部分活性代谢产物的一般原则来进行其活性代谢产物的研究。

同时服用药物制剂与食物可能会造成相同测定时间的血浆中药物浓度的改变，因此禁食与非禁食试验需要设计不同的采血点。

如果样本的给药前血药浓度≤ Cmax 的5%，则该样本的数据可以不经过调整用来计算PK参数。反之，如果药前血药浓度超过Cmax的5%，建议不将该样本的数据纳入生物等效性研究中。在速释药物的生物等效性研究中，如果有样本在Tmax的两倍时间及之前出现了呕吐，则该样本的数据将不纳入统计。而在缓控释制剂中，如果受试者在研究中的给药后任意过程出现呕吐现象，该样本数据将不被采用。

1. 11 代谢物的测定

在生物等效性研究中采集生物样本的测定包括药物的活性成分或者剂型中的活性组分，以及活性代谢产物。生物等效性研究的指导原则建议如下：仅测定剂型中的母体药物，而不是其代谢产物。该建议的理由为母药的浓度时间曲线相比代谢产物而言更能反映制剂的吸收，分布，代谢及排泄的特性。

1. 12 生物样本的采集及采集点的设计

在给药后的不同时间点采集的适当生物样本，进行包括血液，血浆/血清以及尿液的分析。根据供试品的PK特性设计采集点。在大多数研究中，一般进行血浆或者血清样本的测定。然而，如果母药不经过代谢大部分以原型药物的形式排泄，能在尿中进行检测，因此在血浆/血清中的药物浓度不能进行准确的测定的情况下，尿中的药物水平能被用来进行生物等效性的研究。

在药物的吸收阶段应设计足够的样本采集点来拟合药时曲线中的上升阶段。在预期的达峰时间点周围可设计较为密集的采集点。在药物消除阶段也应该设置足够的采集点来满足计算消除速率常数及半衰期的要求。采集时间点的设计应达到至少4-5个半衰期，或者需检测的超过一个分析物时，应达到最长分析物的4-5个半衰期。样品采集应当操作规范，在适当的条件下进行储存以保证分析的完整性。

欧盟对生物等效性的要求

研究设计应该遵循活性物质的PD和/或者PK研究。可参考“人体药代动力学研究”指导原则。该研究的设计及执行应该遵循欧盟的GCP及伦理委员会的要求。

1. 1 研究设计

该研究的实验设计应能区分为制剂的效应而不是有其它的因素影响。一般采用2种制剂的对比，包括2个研究周期，2个交叉设计。然而，在某种情况下，提供的研究设计及统计分析应该有一定的科学性，可以考虑以下两种实验设计：长半衰期药物采用平行设计，代谢变异性较高的药物采用重复设计。

1. 2 受试者

受试者数量

研究中的受试者数量应该满足样本的统计数量。在交叉研究中最少的受试者数量为12。

受试者的选择

生物等效性研究受试者数量的选择应该满足研究制剂间的差异性。为了减少与制剂无关的可变因素，该研究应该选择健康志愿者参加，除非是由于药物的安全性因素在伦理上不可行时。在大多数情况下选择健康志愿者实验来研究不同制剂的差异，并且该结果也能用于探索其在不同人群的差异，如参比制剂使用的老年人，小孩，肝肾功能损伤的病人等。

1. 3 研究的执行

标准化

为了减少除了服用的药物差异之外的其他可变因素的影响，实验条件应该标准化。因此推荐使用标准饮食和运动，并且指定每天的摄入时间。供试品和参比制剂的服用使用同一体积的液体送服(至少150mL)。在服药后，在采样期间，根据药物组分及服药时间统一进食与饮水(257mL)。

采样时间

采样时间点的设计应该满足描述其血药浓度-时间曲线的要求。在Cmax附近应设置更密集的采血点以便更准确的估计其Cmax。在浓度-时间曲线的第一个采集点应该避免为其Cmax值。为了更好的确定其AUC，应在估计得Tmax前至少采集2个可供定量的样本以估算其Tmax。

样本采集时间也应足够长，应至少满足AUCt为80%的 AUC ∞。在消除阶段应至少设置3-4个采血点以满足估算消除速率常数的要求，该常数将用于估计一个可信的AUC∞。对于速释药物来说，不用设计超过72小时的采集点。因此，对于长半衰期的药物来说，采集到72小时，使用截断的AUCs来比较暴露量也是可接受的。

1. 3.3 禁食或者非禁食的条件

如果需要从禁食和非禁食条件下获取足够信息，一般设计一个4周期单剂量的禁食与非禁食的交叉设计而不是分别设计2个单独的禁食与非禁食的生物等效性试验。这个4周期的交叉设计的研究，能够获得食物对供试品及参比制剂的影响数据。试验餐应该为一个标准非高脂肪工作餐(从脂肪中获取大约30%的热量约650千卡)。该工作餐的组成应包括蛋白质，碳水化合物，脂肪(规定克数，热量以及相对含热量(%)。

1. 4 参比制剂及供试品

供试品应与参比制剂进行对比，参比制剂根据申请人的要求进行选择。基于与原产国的参比制剂之间的生物等效性研究而在其他国家申报时可声明与参比制剂的一致性而简化申请。除非同一生产商(或者它的子公司/授权商)生产的参比制剂在辅料的比例及质量上有显著差异。这些国家会要求得到该原产国的参比制剂相关信息，包括成分，生产过程以及终版的产品说明书。

加拿大对生物等效性要求

受试者选择

研究应选择可能的最少例数，如果有受试者脱落，或者必须从研究中撤离，应在研究文件中解释脱落或者撤离的原因。

1. 1 受试者的选择

无特殊情况的研究应选择纳入健康志愿者。研究者应该保证女性志愿者未怀孕或者在研究期间不会怀孕。在研究的第一次及最后一次服药时进行尿检以供判断。在某些研究中，需要采用病人或者特殊受试者来进行生物利用度的研究，比如不同人群的吸收或者分布有差异，或者是该药物是供特殊年龄段使用的，例如小孩或者老人。

1. 2 受试者的考虑因素

   
   

选择受试者的最重要的目标是选择PK特性差异较小的受试者们。实验设计也会根据该变异性进行分组以平衡这种差异 。

年龄

受试者的年龄应该更集中，以排除与年龄有关的器官功能差异。年龄范围包括18-55岁。

身高 / 体重比

健康受试者的身高/体重比应在正常范围的15%以内。

健康程度

医师通过医学检查以及审阅肝，肾，血液学检查结果来选择健康受试者。如果药物对心脏有作用应该进行心电图检测并记录在研究文件中。实验室异常值应重审并且综合医生的意见进行归纳总结。医生也应该评估受试者的心理情况以排除有不配合研究的倾向或者有可能不会完成研究的病人。患有胃肠道疾病例如溃疡，或者癫痫，沮丧，肝功能紊乱，并且在研究中可能会复发的受试者应该被排除。

1. 3 受试者的数量

根据预期在供试品及参比制剂在AUCt以及Cmax的平均差异选择合适数量的受试者，并且还需要考虑在参加的受试者中AUC与Cmax的变异系数。对一般的药物来说，受试者间的变异系数一般不超过20%；然而由于采样点的问题，或者研究不顺利，受试者间的CV值会较高。受试者数量最少为12例，但是通常会设计更多的样本量。

1. 4 研究中受试者的脱落或者撤离

研究中受试者应是自愿的，无强制性的。受试者的数量应充足，并满足可能的脱落或者撤离。应报告撤离理由(如药物的不良反应)，以及提供受试者的血浆(或者血液或者血清)数据. 在报告中应包括从研究中撤离的受试者的所有检测的数据结果。如果由于受试者个人原因从研究中撤离，该受试者的血液样本将不被用于检测。在研究开始前应有相关的赔偿说明，并且应与医疗研究委员会意见(MRC)或者指导原则一致。

1. 5 试验设计

生物利用度的研究设计应该将除药物以外的可变因素降低至最小，并且尽可能的减小偏差。这部分的指导原则适用于一般情况。其他的设计在研究开始前应与加拿大健康局进行咨询直至获得许可。试验的基本设计方法为2个周期的交叉设计，每一个受试者均服用供试品及参比制剂。当研究中超过2种制剂或者在不同条件下的研究中，受试者需要经过严格的随机分组来接受所有的处理。然而，当处理因素较多导致研究超过1个月时，可采用平衡不完全区组设计。

1. 6 标准化

在研究中的不同阶段均需要尽可能将试验条件标准化-例如，运动，饮食，吸烟以及饮酒。研究更倾向于纳入非吸烟者，如果有纳入吸烟者，那么他们的数据应该被注明出来。志愿者在试验前一段时间及试验中不能服用其他的药物，包括酒精饮料和OTC药物。在某些突发情况下，使用其他的任何药物均应报告剂量及服用时间。在统计分析开始前就应该决定纳入或者排除某些偏离已确定的方案的受试者。

1. 7 盲法

如果可能的话，研究应该采用盲法，受试者应不知道其服用的是药物还是安慰剂等。而且监测不良反应与分析样本的研究者们也应该不清楚。其他参与服药过程，病人监测及分析血浆(或者血液，血清)的人员也不了解。

1. 8 进食与饮水

应该严格控制进食及饮水。通常受试者应在服药前禁食10h。仅允许在研究前的晚上饮用无酒精无黄嘌呤的澄清液体。在研究的当天早上服药物前2h服用250mL水。之后用标准体积(如150mL)及温度的水送服药物。服药后2h，可服用 无黄嘌呤的液体 250mL。服药后4h可进食标准餐。研究中的每一天的所有进餐均应标准化。如果是进行口服药物与静脉注射药物的对比研究，在IV组也应该采用与上述口服组同样的进食与饮水标准。某些药物则是在进食标准餐时服用，是为了减少胃肠道的不良反应，也是根据药物的物理化学性质及药物及其制剂的PK特性来确定的。服药同时进食时选择的试验餐应该是具有最大可能改变药物生物利用度。是否同时进餐，试验餐用餐时间，试验餐的内容，与药物同时服用的时间，应该仔细选择并预先确定。

1. 9 采样时间

血样及尿液的采集持续时间应该至少满足达到计算出的AUC0-t为AUC0-∞的80%。准确判断计算药物的消除半衰期的三个时间点。每个受试者每一次服药需要采集12-18个时间点用于计算相关的PK参数。每个时间点也会存在个体间的差异。应记录采样的准确时间。

1. 10 血液及尿液的采集

在通常情况下，采集血液来检测药物浓度。在大多数情况下都是检测血清或血浆内的药物浓度，然而，在某些情况下检测全血来分析药物浓度更为合适。当血液中的药物浓度太低无法检测，并且在尿液中有>40%的未消除的原形药物，则采集尿液来检测药物浓度。采集尿液时，每次的采样体积必须在采集后立即测量并且记录在报告中。在消除相至少采集3个时间点。对于一个24小时的试验，采样时间可定为0-2，2-4,4-8,8-12,12-24小时。应定量测定每一份尿样的肌酐值。有时需要根据药物的性质来确定采集的生物样本，不能局限于血液或者是尿液。然而，药物在分布于例如脑脊液，支气管分泌物等等其他生理液之前肯定是有一个吸收的过程。因此，仍需要采集血样来分析药物浓度来估算生物利用度。

1. 11 供试品及参比制剂

供试品及参比制剂应该有可靠的质量，并且在试验报告中描述剂量，规格及参比制剂等信息。在生物等效性试验中，一般使用每个药物的摩尔等效剂量。生物利用度的比较研究中使用的一批药品应该与上市药品有同样的粒径，同类型的生产设备及同样的生产程序生产。换句话说，生物利用度的比较研究中使用的药物应能代表将要上市的药物。对于普通制剂，如果不同规格间辅料比例，溶解特性相同，可使用一个规格的来确定生物利用度。是否需要使用不同规格制剂来进行研究取决于不同规格之间的差异程度。对于那些治疗窗口很窄，剂量-效应特性陡峭，或者非线性动力学特征的复杂药物来说，应进行药物的每一个规格的生物利用度研究。

1. 12 参比制剂的选择

尽可能的选择原研国口服溶液作为参比。口服溶液也可以为其静脉溶液。在生物等效性研究中，根据食品药品管理条例C.08.004来选择已在加拿大上市的药物作为参比制剂。表1为申报ANDA需包含的内容。表2为准备方案需要的相关内容大纲。

递交生物等效性研究报告格式及内容

生物等效性研究报告应包括完整的方案和执行材料以及依据赫尔辛基宣言和GCP指导原则进行的评价说明。研究应经过一个独立的伦理委员会或者机构审查委员会的批准。研究者应在报告中的各研究部分签字。研究机构，研究中心以及研究时间应在报告中体现。试验中使用的药物及批号，组成成分也应有描述。分析验证报告附在研究报告后。提供体外溶出实验结果。另外，申请者应提交有签字的结果清晰的药物质量分析报告。从原始数据中计算的相关参数例如AUC的方法程序应予以描述。删除数据应描述其理由。如果不采用的常见的PK模型来计算，采用的模型及计算程序也应说明。应该有个体线性或线性范围的血浆药物浓度-时间曲线。报告中应包含所有个体数据结果，包括已脱落的个体数据。脱落或者撤离的个体应该加以解释，应该包括其有代表性的样本检测结果。统计报告应该尽可能的详细，来满足如需重复分析的可能。如果采用的统计方法与方案中规定的方法有所偏离，应给出偏离理由。表3为体内生物等效性研究申报递交的格式及内容，并附有体外的数据。

1. 1 美国

FDA规定，在禁食阶段，80.00%～125.00%作为AUC和Cmax几何平均数90% CI的等效性判定标准。也有一些特殊情况，通常比较仿制药与参比制剂的生物等效性研究也要求在服药物之前进食，以证实食物的影响。食物影响的生物等效性研究也应该采用禁食试验同样的统计评价方法。

1. 2 欧盟

根据欧洲药品管理局在2001年7月发布的药物生物利用度及生物等效性研究指导原则，如果两种制剂使用同样的摩尔剂量产生同等程度的药效及安全性，则证明二者等效并且可替换。即二者AUC和Cmax的90%置信区间位于0.80-1.25则认为等效。

1. 3 加拿大

加拿大药品监管机构的指导原则中也描述了依据系统暴露来进行的生物等效性的确定及研究的执行方法。该指导原则解释了不同药物及制剂由于其物理化学因素，PK性质，临床特性的不同对于检测药物及其代谢产物的方法。供试品与参比制剂的AUCt and Cmax的几何平均数90%的置信区间应在80%-125%以内。

结论

美国，欧盟，加拿大对于研究参数的总体评价均与ICH GCP 指导原则一致。检测血浆PK参数的方法及生物等效性标准也一致。因此，在不久的将来，期待基于临床相关治疗范围的生物等效范围，吸收特性，解决个体间及个体内差异问题的试验设计。

表 1 ANDA 申请材料中的文件要求

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