Nature chemical biology | 扩展FUS相分离中极性残基和精氨酸的分子规则

为了探究FUS无序结构域相分离 （PS） 的结构域相互作用，作者对FUS LC-RGG1 （1-284位残基） 的PS进行了表征。FUS的LC和RGG1结构域在组成上具有明显差异：LC富含极性残基，包括谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸和甘氨酸，并含有两个天冬氨酸和少量疏水残基；而RGG1则含有聚甘氨酸区域，随后是一个富含RGG基序、负电荷残基以及疏水残基 （如蛋氨酸和苯丙氨酸） 的区域（图1a）。在模拟生理条件的缓冲液中，FUS LC-RGG1相较于单独的FUS LC表现出更强的相分离能力，其饱和浓度 （Csat） 约为10μM，比单独的FUS LC低约10倍（图1b）。与FUS LC不同，FUS LC-RGG1的PS会随着离子强度的增加而减弱，这与电荷屏蔽效应一致，表明静电相互作用在其PS中起着重要作用。由于FUS LC缺乏带电残基，这些数据表明同型RGG1相互作用有助于PS。

为了深入探究FUS LC-RGG1的相互作用细节，作者采用了原子分子动力学 （MD） 模拟。链内距离值显示，FUS LC-RGG1比LC和RGG1更塌陷（图1c），这与实验观察到的LC-RGG1增强PS一致。通过模拟，作者比较了每个结构域单独存在与在LC-RGG1中的接触情况（图1d）。尽管当结构域连接时，平均链内接触减少，但LC和RGG1之间出现了大量新的异型结构域-链内接触，同时链内接触也发生了重新组织。虽然酪氨酸-酪氨酸和酪氨酸-精氨酸的接触概率较高，但酪氨酸和精氨酸也与其他残基 （如谷氨酰胺、丝氨酸和甘氨酸） 接触。LC-RGG1的15N NMR自旋弛豫值（图1e）表明，在凝聚相中，与分散相相比，无序链在纳秒时间尺度上的运动更慢。值得注意的是，在凝聚相中，RGG1结构域的弛豫值显示出比LC结构域更快的重新定向运动，尤其是横向弛豫 （R2） ，这可能是因为RGG1中富含甘氨酸残基，增强了主链的柔韧性。

为了确定稳定凝聚态的相互作用在LC-RGG1序列中的分布，作者进行了具有氨基酸类型或位置分辨率的核磁共振 （NMR） 实验，专门设计用于观察分子间接触的方法。作者对所有氨基酸类型之间的链间侧链-侧链和侧链-主链相互作用进行了表征（图2a）。与它们在相分离 （PS） 中的已知作用一致，在最强的核磁共振信号中观察到了明显的酪氨酸和精氨酸位置的NOE增强（图2b），同时也发现了与其他氨基酸的显著NOE，特别是谷氨酰胺。此外，还观察到了精氨酸-精氨酸的NOE，表明RGG1与RGG1之间存在直接相互作用（图2b、c），这可能解释RGG1对增强和改变PS的盐依赖性的贡献（图1b 1e）。尽管在测试条件下RGG1结构域本身不易发生相分离，但这些数据表明RGG1与LC和RGG1都有相互作用。

对LC-RGG1凝聚态的原子分子动力学 （MD） 模拟显示LC和RGG1之间以及同一结构域内形成了链间接触（图2d）。与分散相相比（图1d），凝聚态中的相互作用在酪氨酸和谷氨酰胺位点同样丰富，但在链上分布更广，可能是因为去除了链内构象限制。链间距离显示凝聚态中的构象有所扩展（图1c）LC-RGG1在凝聚态中更为紧凑，LC-RGG1凝聚态中LC结构域内的相互作用与LC凝聚态中的相似（图2d、e），与酪氨酸在许多类朊病毒蛋白的PS中的主导作用一致，酪氨酸形成了许多接触，包括Tyr-Tyr和Tyr-Arg相互作用，以及与LC和RGG1中富集的各种氨基酸的接触（图2e）。精氨酸与酪氨酸有显著接触，也与甘氨酸、谷氨酰胺和丝氨酸接触，这些接触通过多种相互作用模式稳定，包括氢键、疏水相互作用、π-π和cation-π（图2f）。像Tyr和Arg这样的残基可以通过多种方式同时相互作用，有助于它们在PS中的重要作用。通过NOE实验观察到的Arg-Arg接触可能通过精氨酸胍基团的堆积稳定，并通过附近带负电的残基 （如谷氨酸和天冬氨酸） 介导的电荷中和静电相互作用。

图1 FUS LC–RGG1 model for PS

图2 LC–RGG1 contacts include aromatic, arginine and polar residues.

在凝聚相中蛋白被富集，浓度变高可能导致核磁共振 （NMR） 的NOE将那些对PS没有显著贡献的偶然接近体现出来。因此，作者在没有PS的情况下使用分子间NMR实验，来测试在凝聚相的NMR实验和分子动力学模拟中观察到的与非酪氨酸极性残基的接触是否在PS之前就已经形成。考虑到FUS LC-RGG1的溶解度相对较低，作者选择LC作为模型，通过将八个酪氨酸残基替换为丝氨酸（图3a），进一步提高饱和浓度 （Csat） ，以创建2.5mM的样品 （比凝聚相稀释10倍） 。与凝聚相实验一致，作者观察到来自酪氨酸与谷氨酰胺以及甘氨酸和/或丝氨酸之间接触的NOE（图3b）。为了进一步确认在分散相中Tyr-Glu接触的存在，作者对另一种FUS LC变体进行了分子内NOE实验，该变体没有相邻的Q或Y残基，将QY基序替换为SY。这些实验表明，Tyr-Glu NOE并不仅仅来自相邻位置（图3b）。

图3 Contacts between tyrosine and polar residues in dispersed and condensed phases.

作者将某一种残基的全部替换为另一种残基（图4a），并评估其饱和浓度 （Csat） 。为了研究谷氨酰胺的作用，作者将FUS LC和LC-RGG1构建体中LC结构域的所有谷氨酰胺残基分别替换为丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺或丝氨酸。同样地，作者将丝氨酸替换为甘氨酸，苏氨酸替换为丝氨酸，以研究额外甲基的作用，以及替换为缬氨酸以研究羟基的作用。在FUS LC中，作者无法表达和纯化Q→G或Q→N变异体，但在FUS LC-RGG1中这些变异体则可以。作者发现，这些残基在稳定凝聚相中形成的接触对PS有影响。首先，这些替换使得Csat产生了几倍的变化，而不影响酪氨酸或精氨酸的位置（图4b）。其次，FUS LC和LC-RGG1中的变异体对Csat的影响相似，表明RGG1的存在并不改变LC结构域对PS的贡献。具体来说，Q→A、Q→S和Q→N都同样降低了PS，而Q→G与野生型 （WT） 相似（图4b），这意味着谷氨酰胺和甘氨酸与丙氨酸、丝氨酸和天冬酰胺相比有不同的作用。S→G增强了PS。T→S稍微增强了PS，表明苏氨酸的甲基并没有实质性贡献。第三，一些极性残基的替换会导致聚集；在FUS LC中，Q→N导致形状不规则的聚集物，而进行相同替换的LC-RGG1仍保持液态（图4c）。对于T→V，LC变异体立即聚集，而LC-RGG1最初保持液态，但在约5分钟内变为不规则聚集。第四，一些替换似乎改变了盐浓度对相图的影响。在LC和LC-RGG1中，除了在最高盐浓度下，Q→A几乎不发生PS。这些结果表明，非酪氨酸极性残基在FUS PS和聚集过程中起着重要作用。

接下来，作者在FUS LC中生成了两个特定位点子集的替换序列（图4d）。作者选择了一个包含四个天然QQ基序的位点子集 （4QQ→XX） 和另一个包含12个天然丝氨酸的位点子集 （12S→X） ，将这些位点替换为谷氨酰胺、甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸或丙氨酸。作者发现极性残基替换在两种背景下总体上有相似的效果。在12S→X和4QQ→XX背景下，谷氨酰胺和甘氨酸替换形成了具有相似Csat的液态液滴，这与在FUS LC-RGG1中将所有谷氨酰胺替换为甘氨酸 （Q→G） 的情况相似。丝氨酸和丙氨酸在两种背景下都显示出类似的PS减少。在12S→X背景下，天冬酰胺与丝氨酸和丙氨酸相比进一步降低了Csat，但在4QQ→XX背景下PS相似。这些序列集合中天冬酰胺的偏离相关性图（图4f）表明，极性残基在PS中的贡献是序列依赖。因此，极性氨基酸中，谷氨酰胺和甘氨酸比丙氨酸、丝氨酸和天冬酰胺更有利于PS。

以往的解释认为，甘氨酸导致的溶剂化体积变化是其促进PS的原因。为了深入了解甘氨酸的独特作用，作者对FUS LC野生型 （WT） 和S→G变异体进行了原子分子动力学 （MD） 模拟。与WT相比，S→G在凝聚态中显示出由突变位置与相邻残基形成的接触增加（图4g），这与实验观察到的Csat降低一致。相关性图显示，在S→G中，QY和YY （以及其他残基对） 的接触增加，而由于甘氨酸缺乏侧链，突变位置与其他残基之间的接触减少（图4h）。这些结果表明，甘氨酸通过提供灵活性并允许其他残基之间形成接触，从而间接促进PS，而不是通过增强甘氨酸与其他残基的直接相互作用。

图4 Polar residues alter phase equilibria by their identity and distribution

将液体形式转化为聚集体的分子规则已被总结为诸如“甘氨酸维持流动性，而谷氨酰胺和丝氨酸促进固化”之类的规律。为了进一步研究极性残基如何影响液固转变 （LST） ，作者测试了 FUS 变体随时间聚集的能力。作者使用静止和摇动条件，通过差分干涉对比显微镜 （DIC） 在 24 小时内监测聚集的开始和形态，并通过测量硫黄素 T （ThT） 荧光来定量淀粉样纤维的形成情况。在静止条件下，FUS LC 野生型 （WT） 、S→G 和 T→S 形成圆形液滴，没有聚集，而 T→V 立即形成聚集。在 LC-RGG1的实验中，WT 在 24 小时末形成少量不规则聚集物，4 小时后 ThT 荧光微弱增强，而 S→G 或 T→S 均未显示 ThT 增强或显微镜下观察到的不规则结构。因此，LC 结构域中的苏氨酸 （其在 Cβ 位置的分支结构使蛋白质链倾向于形成 β-折叠结构） 和丝氨酸有助于 FUS LC-RGG1d的LST。相比之下，LC 中的 Q→A 不形成微米级的液滴或可见聚集物。在 LC-RGG1 中，Q→A 和 Q→S 的 ThT 增强与 WT 相似，且在几小时后形成不规则聚集物，而 Q→N 比 WT 聚集更快，Q→G 则相反。因此，尽管谷氨酰胺与LST有关，但它并非类朊病毒结构域聚集所必需。

在摇动条件下大多数情况下聚集速度更快，一些序列特异性差异变得明显，但结果大致类似。T→S 在静止条件下不形成 ThT 阳性聚集物，但在摇动条件下约 8 小时后形成显微镜下和 ThT 增强检测到的聚集物，表明天然苏氨酸并非聚集所必需，但会加速这一过程。S→G 仍保持类液态，未显示 ThT 阳性，这代表丝氨酸而非谷氨酰胺是 FUS LC-RGG1 聚集所必需的。

图5 Polar residue identity contributes to the LST.

改变天然丝氨酸位置 （12S→X） 在摇动条件下对聚集产生了显著的影响（图6a、b）。带有天然丝氨酸的野生型最易聚集，而将丝氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺则根据形态和ThT荧光减缓了聚集作者接下来旨在进一步缩小FUS LC中对聚集贡献最大的特定序列区域，作者创建了三个序列，将12个丝氨酸中的4个替换为丙氨酸，并将这些肽段用于的聚集测定（图6d）。作者发现，替换前四个位置 （S30A、S44A、S48A和S53A） 的聚集延迟几乎与12S→A相同，而其他两种变体在统计上与野生型无异。这一发现表明这些特定的丝氨酸残基在聚集过程中起着关键作用，并暗淀粉样结构核心可能就是此处形成的结构（图6f）。

图6 Serine sidechains drive aggregate formation from FUS LC droplets

文章拓展了已有的对氨基酸影响相分离模式的认知，强调极性残基和精氨酸在PS中的重要作用，并揭示了残基贡献的位置依赖性。在极性氨基酸残基中，谷氨酰胺对PS的贡献具有序列和位置特异性，无论是在PS之前还是在凝聚相中，谷氨酰胺都能够与酪氨酸、精氨酸及其他氨基酸残基接触。甘氨酸通过促进相邻氨基酸残基之间形成有利接触来增强PS，并抑制液-固转变。极性氨基酸残基还对液-固转变产生序列特异性影响，其中丝氨酸的位置与FUS低复杂性结构域形成淀粉样核心结构有关。谷氨酰胺、丝氨酸等极性残基和精氨酸在FUS蛋白的相分离 （PS） 中都发挥重要作用，它们通过多种相互作用模式 （如氢键、静电相互作用等） 稳定凝聚态。此外，PS和LST受多种因素影响，包括残基的类型、位置、序列特异性以及它们之间的相互作用模式。

供稿 | 朱辰旭

责编 | 囡囡

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