▲第一作者：Zihao Ou
通讯作者：Guosong Hong
通讯单位：美国斯坦福大学
DOI：10.1126/science.adm6869 （点击文末「阅读原文」，直达链接）
Science编辑Marc S. Lavine评论：
生物组织的光学成像受到光的散射和在较小程度上限制穿透深度的光的吸收的阻碍。Ou等人通过一种起初看似违反直觉的方法解决了这个问题：引入高吸收分子。作者们展示了添加在近紫外和蓝色区域吸收的常见染料分子能够提高附近较长波长的光学透明度。本质上，通过在蓝色区域引起急剧的吸收，光谱红色部分的折射率得到增加，而吸收并未增加。添加酒石黄能够使活体啮齿动物的皮肤暂时变得透明。
生物物质的复杂结构因光散射和吸收而导致不透明，这限制了光学成像的穿透深度。在大多数组织中，散射系数比吸收系数大10到1000倍；因此，散射过程会严重限制常规显微镜中的成像深度和空间分辨率。如果能够实现光散射的大幅减少，这将显著增强明场、荧光、非线性和超分辨率成像技术。光学成像在生物学和医学中起着核心作用，但受到活体组织中的光散射的阻碍。本文报告了一个违反直觉的观察结果：强烈吸收的分子可以在活体动物中实现光学透明性。本文探索了这一观察结果背后的物理原理，发现当强烈吸收的分子溶解在水中时，它们可以通过Kramers-Kronig关系修改水介质的折射率，以匹配高折射率组织成分（如脂质）的折射率。本文证明，本文的简单方法可以可逆地使一只活鼠身体变得透明，从而允许观察到一系列深层次结构和活动。这项工作表明，寻找高性能光学清晰剂的研究应该集中在强烈吸收的分子上。1.酒石黄是一种黄色至橙色的水溶性单偶氮化合物，因其在光谱的蓝色区域具有高吸收性而用作食品制造中的常见合成色素。它是一种吸湿性化合物，在水中具有高溶解度和最小的反应性。欧洲食品安全局（EFSA）已得出结论，这种分子在每公斤体重2克的剂量下不显示任何不良效应或系统性毒性。因此，它被广泛用作风味薯片（例如多力多滋）等产品中的人造食用染料。当溶解在水中时，酒石黄溶液显示出其特征性的黄色至橙色（图1A），因此它的常见名称为“FD&C黄色5号”。酒石黄溶液的紫外-可见光（UV-vis）吸收光谱显示出两个主要峰值位于257和428纳米处，但在~600纳米以上几乎没有吸收。本文通过质谱法验证了本研究中使用的酒石黄的化学成分。2.本文首先展示了染料溶液消除含有胶体二氧化硅（折射率=1.43）颗粒分散在水溶液中的不透明悬浮液散射的能力。具体而言，0.6 M的酒石黄溶液使这种原本不透明的介质在可见光谱的红色区域实现了完全的光学透明。相比之下，传统的光学清晰剂（OCAs）如甘油——已被证明可以适度减少体内的散射——在同一浓度下无法在散射介质中获得相同的透明度（图1A和B）。本文假设吸收性染料可以通过抑制生物结构固有的散射来实现活体组织的光学透明。1.根据Kramers-Kronig关系和Lorentz模型预测结果，随着吸收分子的共振吸收波长增加，它们在提高介质的n′方面将变得更加有效。为了说明这一点，本文模拟了三个Lorentz振子，它们的共振分别位于100、250和400 nm（图2B和C）。位于100 nm的Lorentz振子在n′′中表现出微弱的吸收，导致可见光谱中n′的增加较小。相比之下，预测位于400 nm的Lorentz振子是一个更强的吸收体，具有更高的峰值n′′，因此在较长波长处更有效地增加n′。2.这一理论预测得到了实验验证，如常见的OCA甘油在84 nm处的微小摩尔吸收系数α为0.012 M−1所示，对应于溶解在水中时可见光谱中的微小摩尔∆n′系数β（定义为每摩尔浓度溶解OCA引起的介质n′变化的系数）为0.0129 M−1（图2D和E）。这一发现揭示，传统的OCAs如甘油提高了组织的RI，因为它们本身就是短波长、极紫外（EUV）光谱（通常<150 nm）中的吸收分子。然而，因为它们在极短波长处吸收（可能在可见光谱中完全透明），传统的OCAs不是强吸收体，因此无法有效提高介质的n′。例如，对于甘油的小β值为0.0129 M−1，必须使用浓度为11.6 M（几乎纯甘油）的甘油来提高水的基线n′以匹配脂质。这一要求深深植根于物理学，解释了为什么甘油作为OCA使用时必然导致组织脱水和收缩。图3| 在散射体模和离体鸡胸肉组织中展示光学透明性1.增加散射介质的吸收已被证明可以通过抑制导致背景噪声的散射光子来提高成像分辨率。本文的结果与此相反，不是由于染料分子吸收散射光子，而是源于组织中散射事件的减少。为此，本文使用模仿组织的散射体模进行了实验（图3A）。通过将折射率为1.43的二氧化硅球体（接近脂质和胶原的折射率）均匀混合在具有1.33背景折射率（与水相同）的光学透明水凝胶中来制作这些散射体模。以6毫克/毫升的浓度使用的琼脂糖将水固化成水凝胶，对介质的折射率影响最小。2.本文优化了球体的密度，以达到与肌肉组织相同的散射系数幅度~10 cm−1。基于时域有限差分（FDTD）技术的波动光学模拟显示了粒子如何散射光线并干扰入射平面光波的传播（图3B）。然而，当提高水凝胶背景的折射率以匹配散射体的折射率时，尽管存在二氧化硅颗粒，入射波传播时没有明显的扭曲。图4| 通过含有不同酒石黄浓度的散射体模成像分辨率目标1.染料分子可以改善在组织模仿散射介质中深度成像的空间分辨率。本文将散射体模放置在物镜和背光照明的USAF目标之间。通过没有二氧化硅颗粒的清晰体模的显微照片揭示了最小特征，线宽为2.19微米（图4C和D，顶行）。然而，在散射体模存在的情况下，成像分辨率受到了极大的影响（图4C和D，第二行）。随着在体模中增加染料浓度，空间分辨率逐渐提高（图4C和D，底部行），直到清晰地分辨出2.19微米的线宽。本文通过在所有考虑的空间频率和波长上测量调制传递函数（MTF）的增加来量化这种空间分辨率的逐渐提高（图4E到H）。MTF显示出波长依赖性的行为。在较短的波长处，一旦超过最佳浓度，图像就会变得模糊，而在较长的波长处，对MTF和空间分辨率的影响达到了一个平台（图4I）。图5| 通过透明的腹部对小鼠肠神经系统进行高分辨率动态成像1.本文在活体胆碱乙酰转移酶（ChAT）-Cre-tdTomato小鼠的腹部实现了光学透明。ChAT-Cre-tdTomato小鼠在胆碱能神经元中特异性表达tdTomato，这些神经元在肠神经系统（ENS）内是兴奋性的。然后，本文对空肠中的肌间神经丛进行了荧光显微镜成像（图5A），该神经丛位于皮肤表面下500至~800微米的位置。在未经处理的动物中，由于上层组织的散射，无法在这一深度范围内获得可辨识的图像（图5B）。然而，染料分子有效地使空肠上方的皮肤和肌肉变得透明，使我们能够直接观察到用红色荧光蛋白tdTomato标记的胆碱能神经元及其直径小于10微米的神经纤维，在肌间神经丛中（图5C）。2.本文通过解剖上层的皮肤、肌肉和空肠进行体外成像，确认了荧光来源于空肠神经元。与腹部窗口不同，使用染料分子实现的“透明腹部”不涉及任何限制自然肠道运动的外源性硬质材料。因此，本文能够以高达28 fps的高帧率监测肌间神经丛的快速动态运动，这反映了空肠的潜在活动性（图5D）。本文报告了一个违反直觉的发现：当强烈吸收的染料分子局部应用于生物组织时，可以降低这些组织内固有的光散射。这种效应使各种生物组织——包括头皮、肌肉和腹部——变得透明。本文基于洛伦兹振子模型构建了一个理论框架来解释这一现象。该模型预测，在低共振频率（长波长）处有吸收的分子，在分散于水中时比在更高频率处共振的分子更有效地提高水的折射率。为了证实这一假设，本文使用模仿组织的散射水凝胶和离体生物组织进行了广泛的实验和分析。这些测试证实了本文观察背后的机制，并展示了一旦获得透明性后，通过毫米级散射介质可实现的空间分辨率。这种方法使我们能够以可逆和可重复的方式，将活鼠通常不透明的腹部和皮肤转变为透明介质。这种“透明腹部”允许直接观察荧光蛋白标记的肠神经元，捕捉它们在活鼠中反映肠道活性的信号。https://www.science.org/doi/10.1126/science.adm6869
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