作者：Karry
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如果说有哪一门基础医学学科能够更自如地在临床和基础研究之间切换，小编一定要投医学遗传学一票。
二代测序技术的发展、成本的快速下降、大量测序公司兴起，方便了临床大夫对罕见、难辨临床疾病的诊疗，如果能够利用好这些测序资源，深入开展研究，还有可能发表一篇高水平的学术文章。
接下来就跟小编一起学习一下利用全外显子组测序(Whole-exome sequencing, WES)发表文章的套路吧！
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文章的标题看起来就很厉害，发现了癫痫脑病/智力障碍的新基因，但也很吸睛，怎么同一个基因的突变既可以导致丧失功能（Loss-of-Function），也可以导致获得功能（Gain-of-Function）呢？
1．Trio-based WES，选择癫痫脑病/智力障碍的患儿、患儿父母三人分别进行全外显子组测序、测序结果注释、初步分析。上述过程基本交给测序公司进行即可。这篇文章中使用了安捷伦全外显子V5+UTR试剂盒、安捷伦公司出产的临床研究外显子组测序试剂盒，测序平台选择的是Illumina HiSeq 2500。
2．经过对上述获得的测序结果分析，发现4个患儿都携带KCNQ5基因杂合新发突变（父母不带突变只有患儿带）。分析的原则就是要找患者共有、低频、新发突变、保守性高、致病性预测致病可能性大的突变，上述过程可以通过查询在线网站完成，如ExAC, gnomAD, REVEL, Polyphen, SIFT等。最后也是筛选基因过程中最重要的一点，选择与疾病可能相关的基因，这就需要一些相关的背景知识了！
钾离子通道蛋白，在细胞膜电活动中发挥重要作用。而神经元主要通过极化和复极化来产生动作电位，而这个极化/复极过程受到多种钾离子通道的调节。钾离子通道通常为四聚体，跨双层脂膜。由于存在多种亚型的钾离子通道蛋白，编码钾离子通道蛋白亚单位的基因也多达90余种。钾离子通道蛋白亚单位基因突变可以导致心律失常、感觉神经性耳聋、癫痫、胰岛素分泌异常等等等等多种疾病。
在众多的钾离子通道蛋白亚型中，电压门控型的钾离子通道Kv7.1-Kv7.5由KCNQ1-KCNQ5编码，看这命名就知道这5个蛋白结构功能上应该超级像（见下图）。而且查到的这几个突变在KCNQ家的其他成员KNCQ2、3当中也相当保守！（见下图）而KCNQ2和KCNQ3基因突变可以导致良性家族性新生儿癫痫，是的！KCNQ5家的哥哥姐姐们可以导致癫痫！KCNQ5当然也很有可能有这样的技能！兴奋！
至此，其实都可以说都是研究者自己想得美~~要想证明给大家他歪歪的是可靠的，就要拿出进一步的证据！
证据一，临床上证明这4个患者具有相同/相近的临床表型！这需要非常详细、明确的临床表现和诊断，上一张表，亲们感受一下这个细致，这对大多数医生们都是一个看似简单，但实际很难做到的事情，因为临床工作真的太忙了！！！但是想发文章，测序、分析都交给公司了，总要贡献点自己的力量！
点击看大图
到这里，其实这篇文章可以发表了，运气好的话估计可以发个4~5分的文章了！如果还想更进一步，那么就需要更强力的证据、更深入的研究！
证据二，KCNQ5突变型蛋白确实影响了细胞膜的电活动！KCNQ5基因编码的Kv7.5蛋白可以调节神经元M型电流。因此研究者应用膜片钳技术，观察是否KCNQ5基因突变导致了M型电流变化。
1）和野生型相比，P369R突变型稳定了通道的激活状态（激活曲线左移），同时加速了激活的动力学过程，减慢了失活的动力学过程。总之，就是突变型导致神经元活性增加——获得功能！怎么其他突变的改变看起来和这个突变不太一样？
2）和野生型相比，V145G和L341I突变型却把激活曲线右移了，同时减慢了激活动力学！与P369R突变完全相反！神经元被突变搞迟钝了——失去功能！宝宝有点蒙！
图注：激活曲线
图注：激活动力学
图注：失活动力学
3）免疫荧光观察到V145G和L341I突变型的蛋白比野生型少了（见下图）！！！哈哈哈~~终于可以解释了，虽然突变把神经元搞迟钝了，但是Kv7.5突变型蛋白量减少了，所以控制神经元激活的蛋白少了，神经元解放了，活性增加！！
做到这，这篇文章结束了，最终发表在American Journal of Human Genetics (IF=9.03)，其实这个杂志以前一直在13~14分左右呃😓可能现在的测序太容易获得了吧~~
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