常规基于固相载体法的核酸提取试剂盒通常以高浓度胍盐和蛋白酶k进行样本的裂解,然后以乙醇、异丙醇等一元醇作为结合液,并且后续的洗涤液中基本都含有乙醇成分。
图片来源:一种核酸提取裂解/结合液、核酸提取溶液体系及试剂盒的制作方法
在特定条件下,固相载体磁珠表面包被有如硅基、氨基或羧基等,或固相硅胶膜载体,依靠静电、疏水和氢键作用,可实现核酸与磁珠的特异性结合,通过若干次洗涤实现非特异性杂质、盐类等的去除,然后将核酸从固相载体上洗脱下来实现提纯。
磁珠、硅胶膜固相载体上一般会残留一定量的蛋白、大分子和盐类,清洗步骤有助于去除这些杂质。
杂质通常有两种清洗方式,因样本而异。通常分为两步洗涤,第一步会用中等浓度的离液盐和醇去除蛋白质,然后用乙醇清洗以除去盐类。
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“ 核酸提取 ” 学习笔记Step3:核酸的分离纯化
常规的裂解液都含有去污剂 (如SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等) 和盐 (如Tris、EDTA、NaCl等)。
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a.去污剂的作用
破坏膜结构(细胞膜+核膜);
使蛋白质变性+溶解;
破坏DNA与蛋白质间静电作用从而使二者分离。
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SDS作为一种强烈的蛋白变性剂,破坏其疏水作用打开氢键后能与之结合成蛋白质-sds复合结构。
b.盐的作用
提供合适的裂解环境(pH),如Tris;
抑制核酸酶对核酸的降解,如EDTA;
维持核酸结构稳定,如NaCl。
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EDTA(乙二胺四乙酸)在工作中都干了啥?
c.离液盐
如异硫氰酸胍的存在有助于蛋白质的变性和裂解。胍盐能溶解蛋白质,彻底破坏核蛋白二级结构,从而尽可能的去除蛋白等杂质,获得高纯度的DNA。
离液盐同时对于核酸与硅基质的结合至关重要,
并且为增强两者的吸附强度,通常在结合阶段还需加入乙醇或异丙醇。
由于SDS和异硫氰酸胍难于互溶,而在结合阶段直接加入乙醇通过又会干扰SDS、异硫氰酸胍和蛋白的裂解效果,这些流程通常都是分步进行,比如先通过sds和蛋白酶k的初步裂解,然后加入含胍盐的溶液进一步裂解,再加入含醇的结合液进行结合依次完成。
d.蛋白酶k
裂解体系中还可能加入蛋白酶,利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进DNA与蛋白质的分离,同时,也便于后续的纯化操作。
ProteaseK:蛋白酶,消化缠绕在DNA上的组蛋白等之类的东西;
BufferAL:含有高浓度的盐酸胍的裂解液,裂解白细胞和红细胞,盐酸胍是强的蛋白变性剂,也可以使缠绕在DNA上的蛋白变性,将纯的DNA释放出来。同时提供高盐离子环境,促使DNA特异性的吸附到硅胶膜上;
加乙醇的目的:破坏溶液中的DNA分子表面的水化层,有利于DNA吸附到硅胶膜上;此外,还可以在结合过程中加入适当的表面活性剂,如Tween-20,以减少非特异性吸附。
Buffer AW1:含高浓度的盐酸胍和氯化钠,洗掉硅胶膜上非特异性结合的蛋白;
Buffer AW2:成分基本是Tris-Hcl、水和乙醇,作用:洗掉硅胶膜上残留的盐酸胍、氯化钠等盐离子;
Buffer AE:10mM Tris-HCL(pH9.0)与1mM EDTA作用,将硅胶膜上吸附的DNA洗脱下来。