柠檬苦素类化合物主要分布在楝科和芸香科植物中，是一类高度氧化的去甲三萜类化合物。楝科香椿是中国珍贵的用材树种之一，长期以来被用作治疗痢疾、发烧和月经失调的民间药物。我们以云南省西双版纳的香椿枝条为研究对象，从其乙醇提取物中分离出24个新的柠檬苦素类化合物，椿叶内酯A-X(1-24)(图1)。它们的结构和绝对构型通过综合光谱分析、X射线单晶衍射和量子化学计算明确阐明。值得一提的是，大多数获得的化合物具有21-羟基丁烯内酯或23-羟基丁烯内酯部分的特征，半缩醛羟基在C-21或C-23的绝对构型首次由X射线结晶学、核磁共振量子化学计算和TDDFT ECD确定。
在回流条件下，用95%乙醇水溶液提取风干的粉碎的香椿枝条。真空除去溶剂后，得到合并的乙醇提取物。将粗提取物悬浮在水中，然后用乙酸乙酯萃取三次，得到乙酸乙酯可溶性提取物。通过使用含水甲醇洗脱D-101大孔树脂柱，将乙酸乙酯提取物分成两部分。柠檬苦素主要富集在Fr.2中，该级分进一步在微毛细管电泳上用甲醇/水梯度洗脱系统进行柱层析，得到三个级分。Fr.2.2在硅胶上色谱分离，用氯仿/丙酮梯度洗脱，得到五个子级分。
Fr.2.2.1在葡聚糖凝胶 LH-20上用甲醇等度洗脱系统进行色谱分离，得到三个馏分。Fr.2.2.1.2用RP-18以甲醇/水梯度洗脱，得到子级分。将Fr.2.2.1.2.1用硅胶色谱柱以氯仿/甲醇梯度洗脱，用制备型高效液相色谱纯化得到15、16、17。以同样的方式，从Fr 2.2.1.2.2获得化合物2、18、23和24。将Fr.2.2.1.3进行硅胶层析，得到子级分。其中，Fr.2.2.1.3.1通过葡聚糖凝胶LH-20进行凝胶过滤，并通过制备型高效液相色谱进行分离，得到1、6和13。
将Fr.2.2.2用RP-18柱，用甲醇/水梯度洗脱得到子级分。将Fr.2.2.2.2用硅胶色谱柱以氯仿/甲醇梯度洗脱，得到子级分。将Fr.2.2.2.2.3进行制备性薄层色谱，然后用高效液相色谱纯化，得到化合物11和12。同理，从Fr.2.2.2.2.4中得到化合物3。Fr.2.2.2.3用葡聚糖凝胶LH-20和硅胶柱色谱分离，得到子级分。通过制备型高效液相色谱进一步纯化Fr.2.2.2.3.2，得到化合物5、7、9和10。同样，从Fr.2.2.2.3.4中得到化合物14、19和21。
将Fr.2.2.3在葡聚糖凝胶LH-20上进行处理，得到子级分。将Fr.2.2.3.1通过RP-18进行分离，得到子级分。Fr.2.2.3.1.2用制备性薄层色谱进一步纯化，然后通过制备性高效液相色谱得到化合物4、8、20、22。
化合物1为白色无定形粉末，根据其HRESIMS光谱中的[M+Na]+的m/z为465.2231分子离子峰，确定分子式为C
26
H
34
O
6
。1H光谱显示三个单线态甲基，两个对甲基，两个氧化次甲基和三个烯属质子。13C和DET光谱显示存在五个甲基、四个亚甲基、五个次甲基、三个季碳、一个氧化叔碳、两个酯羰基和六个烯烃碳。上述数据表明，化合物1具有四氢柠檬苦素类似物的骨架，具有21-羟基丁烯内酯部分。通过HMBC相关性分析，确定在C-14和C-15之间为双键，C-7存在一个羟基。
根据ROESY实验建立了1的相对构型，和图4所示，21S异构体显示出明显优于21R异构体的优势，以及图5对1的两种可能对映体进行了TDDFT ECD计算，成功地建立了1的绝对构型。因此，1的结构被阐明为一种前所未有的柠檬苦素样结构，具有6/6顺式稠合的A/B环系统，由七元内酯通过环收缩产生。
图2 化合物1-5，8-10的关键COSY和HMBC相关性。
图4 化合物1的21S (A)和21R（B）的实验和计算的13C核磁共振化学位移之间的相关性
化合物2的分子式位C
27
H
36
O
8
。根据1D NMR数据确定有21-羟基丁烯内酯部分。根据HMBC相关性分析揭示化合物存在七元内酯环A、14双键、C-7甲酯基团。C-1和C-8的化学位移表明了C-1和C-8之间的醚键。因此，2的平面结构为四氢呋喃环B。
根据对其ROESY光谱的分析，核磁共振计算和DP4+概率分析，2的C-21构型被指定为21S，利用ECD计算进一步确定了2的绝对构型。
图6 化合物2的21S (A)和21R (B)的实验和计算的13C核磁共振化学位移之间的相关性。
化合物3的分子式为C
33
H
46
O
12
。1D NMR数据表明存在三个乙酰氧基、一个甲氧基、一个双键以及21-羟基丁烯酸内酯部分。根据HMBC相关性分析，确定乙酰氧基分别位于C-1、C-6和C-7上，C-14有双键，C-3位为甲氧基，这表明化合物3是α-开环柠檬苦素类似物。根据对其ROESY光谱的分析，NMR计算和DP4+概率分析，以及 ECD计算进一步确认了该化合物的绝对构型。
化合物4的分子式为C
26
H
32
O
7
。对4的1H和13C NMR光谱数据的分析表明，其结构类似于toonayunnanin D，其特征在于环A中的七元α，β-不饱和内酯部分和14，15-环氧部分，以及在C-7的酮基团。通过ROESY和单晶x光衍射研究证实了4的相对构型，采用DP4+概率分析和TDDFT ECD计算的核磁共振计，确定了4的绝对构型。（化合物5、6和7与4结构相似）
化合物8的分子式为C
26
H
32
O
8
，存在21-羟基丁烯内酯部分， 8的相对构型被指定为与苏伦内酯的相对构型相同。
化合物9的分子式为C
26
H
31
O
7
N，马来酰亚胺环取代了8中的21羟基丁烯内酯部分。
化合物10的分子式为C
26
H
34
O
6
，其1D NMR波谱数据显示特征的21-OH-20(22)-烯-21，23-γ-内酯环。环A中存在α，β-不饱和七元内酯部分。在1D NMR谱中，10的其他信号与1非常相似。根据HMBC相关性分析，确定在C-7上连接了一个羟基，在C-14和C-15存在双键。通过单晶x光衍射研究进一步证实了10的相对构型。（化合物11-15与化合物10结构相似）
化合物16的分子式为C
26
H
34
O
7
，其与10的NMR数据相似，化合物16的C-15上的羰基和C-14上的次甲基取代了化合物10中的双键。（17的结构被确定为16的7-O-乙酰化衍生物）
化合物18的分子式为C
26
H
33
O
6
N，其与16的结构相似， C-17位为马来酰亚胺环。
化合物19的分子式为C
30
H
44
O
8
，基于NMR数据分析，化合物19的结构与14相似，唯一的区别是C-17取代基, 根据其ROESY光谱的分析， DP4+概率分析以及ECD计算，确定了19的结构特征，其具有相对于典型柠檬苦素类似物的前体而言前所未有的C-20R构型。
图9 化合物19的20S (左)和20R (右)的实验和计算的13C NMR化学位移之间的相关性。
化合物20-22的分子式分别为C
27
H
36
O
9
、C
29
H
38
O11、C
27
H
36
O
9
，根据NMR数据分析，发现它们的结构分别类似于川楝素I，川楝素E和川楝素H， 它们的C-17位为21-羟基丁烯内酯部分。（化合物23与22结构相似，化合物24与20结构相似）
将所有分离的化合物首先通过对小鼠巨噬细胞J774A.1细胞中NLRP3炎症体的抑制来筛选。MCC950 (1uM)用作阳性对照。结果表明，化合物9、11、12、14和18在20 uM时显示，乳酸脱氢酶和白介素-1β释放水平低于50%(图A)。此外，化合物9、11、12、14和18以剂量依赖的方式降低了LDH/IL-1β水平(图B-C)， IC50在3.2-9.7 uM之间，CC50高于20 uM，且均没有细胞毒性。为了进一步检测最有效的化合物11和12是否能干扰炎症体的激活，对白介素-1β的分泌和成熟以及半胱天冬酶-1的成熟进行了测试。如图D-G所示，11和12均显著抑制Casp-1成熟和IL-1β分泌，表明11和12可选择性抑制小鼠巨噬细胞NLRP3炎症体。
