基于mRNA的治疗策略主要依赖于mRNA分子的天然功能，即提供编码蛋白质所需的遗传信息。为了提升这些治疗手段的效率并减少潜在的副作用，研究者们正在积极探索mRNA分子的特性及其传递方法的改进，以期达到更佳的治疗效果。在mRNA治疗领域，工具的开发正朝着提高靶向性、调节性和临床适用性方向发展。尽管现有研究正致力于优化传统方法，但同样也有必要探索创新策略，以充分发挥mRNA治疗的潜力。本文将探讨合成生物学在mRNA治疗中的应用前景，包括模块化自组装mRNA纳米颗粒、在单个mRNA分子上构建逻辑门等创新概念。
mRNA作为生命科学中的核心分子，扮演着至关重要的角色。它位于遗传信息流的中心，负责将DNA中的遗传密码转录成能够指导蛋白质合成的信使。这一过程不仅体现了从DNA到蛋白质的直接联系，而且通过蛋白质的多样性和它们与众多有机与无机分子的相互作用，构建了一个复杂的生物活性网络，这是生命活力的根本。在这个网络中，mRNA作为信息传递的关键媒介，受到了科研界的极大关注，并激发了对其操作和应用的深入研究。
经典mRNA分子的结构由四个关键部分组成：5′端帽子结构、5′非翻译区（5′UTR）、编码区（ORF），以及3′端非翻译区（3′UTR）和Poly(A)尾巴。5′端帽子结构是真核生物mRNA上一种保守的修饰，它不仅在蛋白质合成的启动过程中起到关键作用，还作为一道屏障保护mRNA免受外切酶的降解。非翻译区位于编码序列的两端，虽然不直接编码蛋白质，但在调控mRNA的翻译效率和稳定性方面发挥着重要作用。5′UTR是核糖体结合的区域，对翻译起始至关重要，而3′UTR则含有调控mRNA的亚细胞定位、蛋白质折叠和稳定性的元件。编码区包含决定蛋白质氨基酸序列的密码子，密码子的选择对翻译效率有显著影响。研究显示，偏好使用频繁的同义密码子和密码子使用偏向性可以通过增加特定tRNA的重用或提高局部tRNA的浓度来增强翻译效率。Poly(A)尾巴由一系列腺苷酸组成，它与5′端帽子结构相互作用，促进mRNA的环化，对mRNA的翻译和稳定性起到关键作用。与此不同的是，环状RNA（circRNA）作为一种新发现的非规范剪接产物，其结构和功能与线性mRNA有所不同，为mRNA研究领域带来了新的视角。
为了充分发挥mRNA作为治疗药物的潜力，科研工作集中在深入理解、改进和优化构成经典mRNA分子的主要成分。目前已经开发出多种加帽技术，例如抗逆帽类似物（ARCA）和CleanCap，这些技术能够增强mRNA的稳定性和翻译效率。人类α和β珠蛋白基因的UTR因其高效的翻译和稳定性而被广泛应用于mRNA合成。此外，UTR的设计也考虑了二级结构，以增强mRNA的稳定性或优先翻译性，如核糖开关，这在治疗应用中尤为重要。
对于Poly(A)尾，研究已经确定了其长度对mRNA表达和稳定性的影响，并找到了最佳长度，以减少因尾部缩短和过度腺苷酸化导致的mRNA衰减。除了mRNA成分的研究，核苷修饰如假尿苷和N1-甲基胞嘧啶已被证实能够产生更稳定的mRNA。这些修饰降低了蛋白激酶R（PKR）的活性，从而减少了PKR介导的翻译起始因子亚基的磷酸化，降低了细胞的翻译能力，同时增强了对RNase L的抗性，并减少了促炎细胞因子的释放。
然而，如果没有有效的递送方法，即使mRNA操作得当，也难以实现预期的治疗效果并减少潜在的副作用。裸露的mRNA递送由于核酸酶的降解而效果不佳，导致大部分mRNA无法到达靶细胞。即使到达的mRNA也往往通过脂质筏——洞穴状结构进入细胞，并在溶酶体中积累，导致降解，只有极少量的mRNA能够逃脱溶酶体并到达翻译机制。
为了解决这些挑战，已经开发了多种mRNA递送方法，包括脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物和细胞穿透肽（CPP）。LNP是最先进的mRNA递送系统之一，通过内吞作用促进细胞转染，由可电离的阳离子脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）组成。在聚合物中，聚乙烯亚胺（PEI）和聚（β-氨基）酯（PBAE）是最常用的材料。鱼精蛋白作为一种CPP的阳离子肽，已被广泛研究，作为细胞内mRNA递送的有前途的工具。鱼精蛋白通过结合有效地保护mRNA载荷免受核糖核酸酶的降解，并促进其安全运输到细胞质中，使其常用于基因治疗和基于mRNA的治疗。这些递送策略的发展对于实现mRNA治疗的临床应用至关重要。
mRNA分子的研究进展和递送技术的革新，极大地推动了mRNA技术从实验室到临床应用的转变。众多精心设计的mRNA治疗方案已进入不同阶段的临床试验，为多种健康挑战提供了治疗途径。针对COVID-19的数种疫苗已获得批准，而针对狂犬病、流感和急性HIV感染等其他病毒的疫苗研究仍在临床试验阶段。同时，针对黑色素瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤等癌症，囊性纤维化等遗传性疾病，以及以2型糖尿病为代表的代谢性疾病和心血管疾病的mRNA癌症免疫疗法的临床试验也在积极进行。这些药物正处于I期和II期试验阶段，彰显了mRNA治疗策略的巨大潜力。
mRNA技术与合成生物学的结合，加之计算机技术的假定进步，预示着未来二十年mRNA治疗策略和应用的广阔前景。这种跨学科的融合为开发新的治疗手段和医疗策略提供了巨大的潜力。
在mRNA疗法领域，基于mRNA在中心法则中的核心作用——即编码蛋白质的表达——取得了显著进展。这一进展为多种应用奠定了基础，其中翻译是关键步骤。以下是mRNA疗法的几个关键应用领域：
mRNA疗法在慢性疾病治疗中的一个重要应用是蛋白质替代，特别是在糖尿病、贫血和心肌梗死等疾病中。通过将编码特定蛋白质的mRNA递送到目标细胞，可以实现这些蛋白质的局部表达，从而补偿蛋白质的缺失或不足。
基于mRNA的癌症免疫疗法通过递送编码癌症特异性抗原的mRNA，触发机体对恶性肿瘤的免疫反应。此外，还可以通过递送编码嵌合抗原受体（CAR）的mRNA直接转染免疫细胞，增强其对癌细胞的识别和杀伤能力。
mRNA在基因组工程中也发挥着重要作用，通过表达核酸酶（如ZFN、TALEN或Cas9）来诱导靶向基因修饰。这些技术可以用来修复遗传缺陷或引入新的遗传特征。
mRNA还被用于细胞的遗传重编程，通过表达关键转录因子增强细胞的多能性，这对于再生医学和细胞治疗具有重要意义。
5. 反义寡核苷酸（ASO）和RNA干扰（RNAi）疗法
与基于mRNA的疗法不同，ASO和RNAi疗法不是通过递送mRNA来编码特定蛋白质，而是通过调节细胞内现有mRNA分子的水平来发挥作用。在ASO疗法中，短单链核苷酸与互补的RNA序列结合，形成DNA-RNA双链，被RNase H酶识别并切割RNA链，导致目标mRNA降解，从而下调目标基因的表达。RNAi疗法则通过引入单链或双链RNA分子，由RISC复合物处理并引导其靶向特定mRNA分子，导致其降解，下调相应基因表达。
ASO和RNAi疗法是基因调控的宝贵工具，已显示出用于各种治疗应用的潜力。特别是ASO疗法，可用于外显子跳跃，纠正特定外显子上的突变，帮助恢复开放阅读框，可能治疗遗传疾病。这些方法提供了调节基因表达的替代方法，有望治疗多种疾病。综上所述，mRNA疗法及其相关技术在医学领域中的应用前景广阔，不仅能够提供新的治疗手段，还能够为基因调控和基因治疗提供新的策略。随着技术的不断进步和研究的深入，这些疗法有望为多种疾病的治疗带来革命性的变革。利用mRNA技术开发的COVID-19疫苗是该技术应用的一个典型例子，该疫苗通过体外合成mRNA来在体内表达病毒抗原。这些研究的成果为mRNA生物制品的市场化提供了动力。但在这些应用能够完全发挥其潜力之前，必须解决一些技术难题。
使用mRNA作为治疗手段并非新概念，正如Robert W. Malone在1989年所展示的，脂质体包裹的mRNA能够在培养的真核细胞中被翻译。尽管这项研究具有开创性，基于mRNA的治疗策略的发展和应用却耗费了近三十年。这种进展的缓慢主要是由于对mRNA特性的认识不足。
mRNA分子本身易于被普遍存在的核糖核酸酶降解，并且在pH值超过6的环境中容易发生水解。此外，缺乏合适载体的情况下，mRNA穿透细胞膜进入细胞质并表达其编码蛋白的几率极低，概率不足1/10000。同时，mRNA的免疫原性问题也对体内研究的有效性构成了挑战。
针对mRNA的这些特性，大量研究正集中于开发递送系统和实施GMP标准，以制造用于治疗的体外转录mRNA。解决mRNA稳定性、细胞内摄取和免疫原性的问题，对于促进基于mRNA的治疗技术的发展至关重要。根据EMA和FDA的规定，遵循mRNA的优良生产规范（GMP）对于保障治疗性产品的安全性与品质至关重要。GMP指南强调，试剂应避免使用动物源性成分，或在必须使用时进行详尽的分析与检测，以预防在传统治疗制备过程中可能出现的非预期安全问题。
在体外转录mRNA的过程中，通常采用DNA模板，例如质粒DNA或PCR产物。依据研究的规模，生产流程包含多个环节，例如DNase消化、LiCl沉淀以及反向FPLC，这些步骤旨在提纯单链mRNA并清除所有残留的DNA、酶类、NTPs以及双链mRNA。这些严格的纯化措施对于确保最终mRNA产品的纯净度和无污染至关重要。
与活病毒、病毒载体、灭活病毒及蛋白质亚单位等其他技术平台相较，mRNA疫苗的生产周期显著缩短，有效降低了生物和化学污染的风险。以BionTech针对SARS-CoV-2开发的mRNA疫苗为例，其生产过程完全遵循GMP标准，在认证的设施中进行。每批疫苗均需经过污染物和有毒物质的标准检测，并出具相应的检测报告，以确保疫苗的安全性和质量。
相较于活病毒、病毒载体、灭活病毒和蛋白质亚单位疫苗，mRNA疫苗的生产周期更短，这有助于减少生物和化学污染的潜在风险。对于mRNA疫苗而言，其脂质载体的选择性分布至特定组织是经过精心设计的。这种选择性主要通过筛选脂质库来实现，以评估其对组织的偏好性。实验数据揭示，当注射含有mRNA的脂质纳米颗粒（LNPs）时，大约75%的颗粒会留在注射部位，大约21%会积聚在肝脏，而不到1%会分布到脾脏。这些发现强调了纯化步骤在确保mRNA产品无污染方面的重要性。
确实，mRNA疫苗的特性决定了它们在触发体内抗原呈递后会被清除。这一过程主要是由细胞内的核糖核酸酶（RNases）和mRNA较短的半衰期所驱动。与DNA疫苗不同，mRNA分子不进入细胞核，因此不会在细胞核内进行翻译，这意味着它们不会与人类基因组发生整合。因此，接种mRNA疫苗不会带来长期基因突变的风险。
综合考虑，这些疫苗中精细设计的脂质载体结合mRNA分子的特性，提供了一种既安全又有效的激发免疫反应的途径，同时避免了对人体基因组造成任何长期改变的风险。
SARS-CoV-2 mRNA疫苗的临床研究结果表明，其副作用通常轻微且短暂，这暗示了mRNA疫苗方法的高安全性。
总体来看，严谨的生产流程和临床安全数据为mRNA疗法的安全性提供了支持，这使得mRNA疗法成为了一种有前景且安全的医疗手段，适用于包括疫苗和基因疗法在内的多种治疗领域。尽管存在一些伪科学的说法，但由于人体细胞内缺乏逆转录酶，mRNA疗法无法整合入宿主基因组。所有支持这些伪科学观点的实验（遗憾的是，有些已经发表）都是具有误导性或设计不当的，最终都未能站得住脚。科学的本质在于通过合理的实验设计来探究事实真相。缺乏对照组的实验设计或不当/操纵性的实验并不能代表科学探索的真正含义。
目前，经临床批准的mRNA技术尚存在一些限制，包括缺乏对特定细胞类型的精准靶向、产品表达水平的调节能力，以及在细胞内的持久表达特性。这些限制通常导致需要大量注射mRNA以及频繁的接种。科研人员正在积极探索解决这些限制的新方法，以推动mRNA治疗领域的进步。
一个活跃的研究领域集中在将mRNA疗法精确递送到特定的细胞类型，特别是在优化脂质纳米颗粒（LNP）的配方上。LNP由阳离子可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）组成，对mRNA疫苗的效能发挥着关键作用。尽管如此，由于个体间的差异，LNP可能触发超敏反应和免疫介导的不良事件。因此，对LNP进行优化是必要的，这有助于减少在体内特定区域的积聚，并避免LNP成分激活补体系统。虽然许多研究者通过筛选脂质库来寻找能够被目标细胞吸收的脂质组合，但也出现了一些创新的解决方案，比如在LNP表面附加蛋白质，以限制mRNA载LNP的细胞趋向性。一种这样的方法是利用名为ASSET的膜锚定单链抗体片段（scFv）将抗体固定在LNP上，使得LNP能够针对表达CD3、CD5或β7整合素的不同白细胞。另一项研究展示了通过在携带mRNA编码信息的LNP表面进行修饰，实现了对T细胞的靶向性，通过CD5特异性抗体对T细胞进行重编程，促进体内CAR-T细胞的产生。
mRNA疗法的调控也受到顺式作用元件和反式作用因子的影响，包括剪接因子、RNA结合蛋白以及依赖于miRNA的内源性mRNA调控机制。这些因素为mRNA疗法提供了额外的调控节点。可变剪接在调控基因表达中扮演着关键角色，mRNA的剪接异构体或特定蛋白质水平的变化可以直接决定蛋白质的最终功能。以纤连蛋白（FN1）为例，其可变剪接模式能够改变溶解性与细胞定位，进而影响其在生物体内的功能。
为了实现对特定细胞类型的精准表达，可以通过修改mRNA分子，引入特定的调控元件。其中一种可变剪接的应用是剪接连接表达设计（SLED），它允许对蛋白质合成进行更精细的调控。SLED通过利用细胞类型特有的剪接位点，在编码序列中引入移码，从而根据细胞的剪接特性表达不同的蛋白质。这种方法使得mRNA疗法能够根据特定细胞类型的剪接模式来定制蛋白质的表达。
miRNA在基因的转录后调控中扮演着关键角色。Lockhart等研究者借鉴miRNA的天然功能，控制p27蛋白编码mRNA的降解过程，特别是在内皮细胞中。他们通过这种策略，成功实现了在血管平滑肌细胞中的目标表达。
总体来看，这些精细的调控机制能够精确调控mRNA疗法的表达，实现对特定细胞类型和组织的靶向治疗。这种精密的方法有望为多种疾病开发出高度个性化且有效的治疗策略。此外，基于蛋白质的mRNA递送系统和真核生物中的立足点开关提供了额外的策略，这些可以通过进一步的研究来增强所应用mRNA疗法的特异性和效果。
注射后mRNA在体内的活性调节是确保mRNA治疗策略安全性的一个关键因素。与Her-2靶向的过继细胞疗法相关的严重事件突显了对复杂生物制剂进行外部控制的必要性，并强调了对潜在严重副作用进行谨慎管理的重要性。为解决这一挑战，研究人员正在探索包括设计可自我复制的RNA分子在内的多种方法，这些分子可以通过FDA批准的小分子药物（例如甲氧苄啶）进行调控和剂量调整，从而实现对mRNA表达水平和治疗效果的微调。
提升转染细胞内应用的mRNA的稳定性可以减少所需的mRNA总量，同时保持治疗效果。如前文所述，当前研究正致力于通过优化mRNA分子的各个区域（包括5′非翻译区、3′非翻译区、5′帽结构和Poly(A)尾）来延长mRNA的半衰期。在Wesselhoeft等人的一项研究中，他们提出了一种新策略，即将含有IRES的RNA环化，形成环状RNA（circRNA）。研究发现，含IRES的环化RNA的表达效率与线性mRNA相当。在后续研究中，circRNA显示出对Rig-I等先天免疫分子的惰性，不会引起TLR的过度激活。此外，Chen等人还证实，通过合理设计circRNA可以增强其翻译效率和整体稳定性。这些研究成果为改进mRNA疗法并提高其长期有效治疗的潜力提供了重要的指导。
当前的研究致力于解决mRNA治疗策略的三个关键问题：特异性、可调节性和持久性。这些研究进展预示着未来我们能够开发出更少副作用、更低注射频率、更高安全性和更有效的治疗方案。
确实，缩小mRNA技术差距的工作主要集中在利用mRNA分子的内在特性，尤其是其在细胞内的翻译机制。科研人员正致力于通过直接修改mRNA或优化递送系统来实现预期的治疗效果。
在mRNA治疗领域，过去20年的研究主要集中在利用mRNA的固有特性。然而，通过融入合成生物学的理念，研究人员现在能够通过引入非天然成分来重新构想或重新设计这些天然特性。这种将天然属性与合成元素结合的策略有可能显著提升mRNA治疗的潜力。虽然这一转变看似具有革命性，但实际上它更多地代表了方法论的整合。将天然和合成方法相结合是合成生物学的核心，预计在未来几十年内将引领mRNA治疗的新浪潮。本项工作探讨了两种不同的策略，阐释了这种整合如何彻底改变基于mRNA的治疗应用。这些策略展示了如何通过增强mRNA治疗的效果、特异性和安全性，使其成为治疗多种疾病的创新方案的先锋。
mRNA治疗技术主要包含两个关键组成部分：mRNA分子及其递送系统。这两个要素均经过了深入的优化，以确保在多种医疗应用中实现预期的疗效。mRNA分子负责编码目标蛋白质，而递送系统则确保mRNA能够高效地进入目标细胞，同时避免被核酸酶分解。在mRNA治疗技术的研发中，对这两个组成部分的优化是至关重要的，它们共同决定了治疗效果的有效性和高效性。
利用合成生物学的策略，可以简化mRNA疗法的优化流程，将mRNA分子设计成兼具编码和递送功能的单一实体。这种方法有望将原本需要优化的两个要素简化为一个，即mRNA分子本身。核酸（例如DNA和RNA）因其能够结合和传递其他分子而受到广泛关注，它们作为递送载体的潜力正在被积极探索。研究表明，尽管结构复杂的自组装mRNA分子对核糖体的可接近性较低，但它们仍具备翻译能力。通过结合mRNA的非自然负载和自组装特性，以及其天然的翻译能力，可以开发出一种集成化的mRNA疗法。这种集成化的方法不仅简化了研发和优化流程，而且可能为多种医疗状况提供更有效的治疗方案。
的确，mRNA分子内部核苷酸间的非共价相互作用能够形成特定的三维结构，这些结构可以被特定的细胞受体识别，与适体-蛋白质相互作用类似。这种精确的靶向和递送机制能够增强mRNA疗法的专一性和效率。控制核酸空间结构的能力，通过非共价相互作用，是一个充满潜力的研究领域，它在医学的多个分支中展现出广泛的应用前景。这一特性确保了mRNA治疗的精确靶向性。
为了构建一个具备适体结构以识别并结合靶标受体的mRNA支架，设计成纳米颗粒以保护mRNA免受降解，并搭载可替换的编码序列以适应多样的应用场景，必须进一步发展用于精确控制mRNA空间结构的计算方法（见图1）。将合成生物学的原理融入mRNA治疗策略是至关重要的，并且具有巨大的发展潜力。这种整合允许我们将自然组件重新组合，构建出非天然的系统，进而优化mRNA的递送和翻译效率，以提升治疗效果。通过这种方法，可以精确调控mRNA的结构和功能，实现对治疗分子的精准递送，为治疗多种疾病提供了新的可能性。
图1. 自组装 mRNA 纳米颗粒的设计。在计算机上对 mRNA序列进行修饰对于实现靶向性、不可降解性和可互换性至关重要。当设计的 mRNA 在体外转录时，自组装过程同步发生。除此之外，自组装的 mRNA 将是可改变的适体，以触发进入特定细胞类型。颗粒的致密性将防止降解。在纳米颗粒内部，转换将根据目的应用进行切换。这种设计的模块化将为基于 mRNA 的治疗提供加速。
合成生物学的另一个关键研究方向是通过合成组件的引入，对自然系统进行重新设计，以实现对这些系统的全面控制。利用计算机工程对非天然部件进行设计，可以对基础的自然系统进行重构，将自然界的元素与人工合成的元素相融合，打造出具有更高控制力和实用性的全新系统。
原核生物和真核生物中的合成开关均依赖于中心法则的自然机制，但它们具有非传统的调控元件。这些基因表达的合成开关能够精确控制，并且在多种应用场景中得到了研究。人们还探索了构建能够响应特定输入并产生预期输出的生物逻辑网络。尽管大多数研究都集中在基于DNA的方法上，但这些系统在诊断和治疗方面的应用也得到了探索。然而，基于DNA的回路存在一些缺点，例如非暂时性的激活、细胞内定位的需求以及基因组整合的风险。鉴于这些限制，核酸结构的创新，特别是CRISPR-Cas技术的发展、eToehold概念以及反式帽独立翻译元件的发现，可能会将研究重点从基于DNA的生物回路转移到基于RNA的诊断和治疗工具。最近，Santangelo和Gersbach实验室的研究展示了一种基于mRNA的治疗方法。他们证实，装载有嵌合dCas9蛋白编码序列的mRNA，通过LNP载体传递，可以直接从基因组转录激活基因表达。这种激活是通过体内sgRNA的精确靶向实现的。这一进展开辟了使用RNA靶向嵌合dCas13蛋白来控制翻译的可能性，以及潜在的基于RNA的电路设计，具有与反式帽独立翻译元件相同的协同作用，可能在体内研究中得到应用。
尽管基于RNA的生物电路可能面临稳定性和与电路工作原理兼容性的挑战，例如RNA的水解可能导致脱帽或整体降解为脱腺苷酸RNA，但将基于DNA的电路整合到单一mRNA分子中，并减轻与DNA相关的缺点，可能成为一种有前景的策略。这种方法为RNA基生物电路在诊断和治疗领域的更广泛应用提供了新的可能性。
在构建单分子mRNA门控电路时，需整合三个不同的eToehold区域以精确调控Csy4核酸酶、Cas13a核酸酶及目标基因的表达（参见图2）。该生物电路设计依托于两种miRNA输入，它们的特定组合赋予了对目标细胞的专一性识别能力。
图 2. 通过单个 mRNA 分子的与门。将 mRNA 分子（左上）递送至细胞后，细胞中 miRNA1 的存在导致 Csy4 酶翻译以切割其识别位点，而 miRNA2 的存在导致 Cas13a 酶的表达。Csy4 的切割释放出 Cas13a 的 crRNA，并导致激活剂 RNA 片段脱离以激活目的基因的翻译。表达目的基因所需的唯一条件是必须在细胞中同时找到两种 miRNA。
miRNA1 的存在触发了 Csy4 CRISPR 核酸酶的表达。而 miRNA2 的存在则诱导了 Cas13a 核酸酶的翻译过程。在含有这两种miRNA的细胞中，两种核酸酶将被同步表达。Csy4 核酸酶通过消化 Csy4 的识别位点上的 mRNA，导致与 Cas13a 核酸酶结合的 crRNA 被释放，这一过程在 mRNA 的红色片段中有所体现。随后，Cas13a 核酸酶与其 crRNA 能够识别并切割 crRNA 的目标位点，该位点在激活 RNA 片段的红色区域中被标识。crRNA 的释放使得激活 RNA 片段得以激活目标基因的表达。
该生物电路的核心特性在于，若细胞内缺失任一miRNA，系统便无法合成最终产物——目标基因。这一设计确保了目标基因的表达受到精确调控，并且仅在两种miRNA共同存在时发生，从而赋予了对特定目标细胞的专一性。
总体来看，这种基于单个mRNA分子的逻辑门电路提供了一种机制，能够根据特定的miRNA输入组合精确调控靶细胞内目的基因的表达。或门（OR Gate）为了利用单个mRNA分子构建“或”逻辑门，需设计两个不同的eToehold区域：一个负责同时调控Csy4和Cas13a的表达，另一个则负责驱动目的基因的产生（参见图3）。这一电路同样采用两种miRNA输入，与之前所述的“与”门类似，但在“或”门的设计中，任一miRNA的存在即可触发目的基因的表达。
图 3. 通过单个 mRNA 分子的或门。将 mRNA 分子（左上）递送至细胞后，细胞中 miRNA1 的存在会导致 Csy4 和 Cas13a 酶的翻译。Csy4的切割会释放 Cas13a 的 crRNA，从而导致 miRNA2 片段脱离，从而激活目标基因的翻译。唯一不会导致目标基因表达的条件是两种miRNA 都必须不存在于细胞中。当细胞中存在 miRNA1、miRNA2或两者时，就会发生目标基因的表达。
具体来说，miRNA1 能够同时激活 Csy4 和 Cas13a 核酸酶的表达。而 miRNA2 则负责启动目标基因的翻译，它位于mRNA分子的末端（以紫色表示）。如果细胞内含有miRNA2，它同样位于mRNA分子的末端。当miRNA1存在时，会触发Csy4和Cas13a的表达，进而导致miRNA2在mRNA末端通过类似于“与”门电路的机制被裂解。这一裂解事件使得miRNA2得以释放，随后miRNA2便能启动目标基因的翻译。目标基因的翻译过程由miRNA2激活的eToehold区域所控制。
在该“或”门电路中，miRNA1或miRNA2的任一存在即可触发目标基因的表达。反之，若细胞内缺乏这两种miRNA，电路则维持非激活状态。
本质上，这种基于单个mRNA分子的“或”门电路能够感应miRNA1或miRNA2的存在，进而激活目标基因的表达。这一机制允许根据特定的miRNA输入，以灵活和多样化的方式调控基因表达。
为了构建基于单个mRNA分子的XOR门电路，需要设计三个不同的eToehold区域：一个用于调节Csy4核酸酶的表达，另一个同时控制Cas13a核酸酶和目标基因的产生，第三个则专门负责目标基因的翻译（参见图4）。该电路同样依赖于两种miRNA输入，这与前面讨论的AND门和OR门相似。然而，在XOR门的情况下，只有当存在一种miRNA时，目标基因的表达才会被激活。如果两种miRNA同时存在或都不存在，电路则不会激活。
