蛋白质的测序方法及策略

文章来源于分子庄园，作者木子庄主

蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定，即氨基酸的线性排列顺序。

蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目、多肽链的氨基酸排列顺序，它是蛋白质生物功能的基础。

蛋白质测序的主要策略是采用化学或者酶消化方法将多肽链拆分，然后测定氨基酸残基含量和组成。

几乎所有的蛋白合成都起始于N-端，目前对蛋白N端测序主要分类两大类，其一为非质谱技术，例如经典的Edman降解法、其二为质谱技术。

1、蛋白质测序的测定步骤

1）多肽链的拆分

由多条多肽链组成的蛋白质分子 ，必须先进行拆分。拆开后的肽链可用层析或电泳进行分离。

a.非共价键

几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。

b.二硫键的断裂

几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

知识贴： 裂解和保护二硫键

1、过甲酸〔performic acid〕氧化法

过甲酸氧化法的原理是利用过氧化氢和甲酸来氧化二硫键中的硫原子，使其断裂形成两个硫氧化物。 不可逆、 -CH2SO3H

这种方法可以在中性或弱碱性条件下进行，不会对蛋白质结构产生影响。

2、巯基还原+氧化法

[ β-巯基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等， 不可逆、-S-CH2-COOH

3、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕法

可逆、 -R1-S-S-R2 + HSO3- R1-S- + R2-S-SOH3

4、巯基(-SH)的保护

3）测定蛋白质分子中多肽链的数目

通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

4）测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。

5）分析多肽链的N-末端和C-末端

多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。

在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法(Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法)，C末端分析法(肼解法；酶降解法；硼氢化锂法)。

6）多肽链断裂成多个肽段

可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

知识贴：多肽链裂解

1.胰蛋白酶：Lys;Arg——C端

2.胰凝乳蛋白酶（糜蛋白酶）：Phe;Trp;Tyr——C端【PH=8~9】

3.葡萄球菌蛋白酶：Asp;Glu——C端

4.Asp-N-蛋白酶：Asp;Glu——N端

5.胃蛋白酶：Phe;Trp;Tyr;Val——N端【PH=2】

6.内切蛋白酶Lys C:Lys——C端

7.溴化氰：Met——C端

7）测定每个肽段的氨基酸顺序

8）确定肽段在多肽链中的次序

利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

9）确定原多肽链中二硫键的位置

一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。

2、Sanger法

1）Sanger测序原理

α-氨基可与DNFB反应，形成黄色的DNP-氨基酸，可用非极性溶剂提取后用纸层析法分离，与标准DNP-氨基酸比对来确定氨基酸种类。该试剂也被用于鉴定蛋白质N端氨基酸，即Sanger法。

肽段N端氨基酸有游离的α-氨基，可以与DNFB反应得到DNP-肽。

由于DNFB与氨基结合牢固，不易水解，故当DNP-肽完全水解后，N端的氨基酸就成为DNP-氨基酸。

由于DNP-氨基酸溶于乙酸乙酯和乙醚等有机溶剂，故可用这两种试剂进行色谱（纸层析）分析，与标准的DNP-氨基酸作为对照，就可鉴定出是何种氨基酸。

既然可以测定蛋白质N端的序列了，那么，如果用酶将蛋白质打断为更多的小肽，产生更多的α-氨基，就可以得到更多序列信息了。

许多酶可以特异断裂某些氨基酸C端或N端的肽键，如胰蛋白酶(Trypsin)可以特异性断裂Lys、Arg的C端肽键，糜蛋白酶(Chymotrypsin)可以特异性断裂芳香族氨基酸C端肽键等。

有了DNP-氨基酸和酶的切点提供的序列信息，就可以像拼拼图一样将测得的序列信息拼接起来，最终得到完整的氨基酸序列。

2）Sanger测序步骤

a.纯化目标蛋白(纯度大于97%)。

b.利用尿素、盐酸胍、极端PH、高盐等拆分肽链，使蛋白质各亚基分离。

c.用DTT、过甲酸等打开二硫键，保证所有肽链都为单链。

d.将单链完全水解为氨基酸，分析氨基酸组成(后续测得序列中各种氨基酸含量应与该步骤得到的数据吻合)。

e.用DNFB、羧肽酶等测定单链N/C端氨基酸组成。

f.用酶、CNBr(溴化氰)等将肽链切割成小片段，再测定每个小片段的序列。

g.拼接序列、定位二硫键。

3、Edman降解法

Edman降解法(Edman degradation)，和Sanger法相似，该方法也是通过一种芳香族化合物-异硫氰酸苯酯(PITC)与蛋白质N端氨基酸结合。

但与DNFB不同的是，PITC可以使得与之结合的N端氨基酸环化，进一步生成苯乙内酰硫脲氨基酸(PTH)衍生物，导致N端氨基酸从肽链上自发解离下来。

该方法逐一地从蛋白质或肽的N端去除氨基酸，并识别每一步去除的氨基酸。

该方法可以连续测定20-30个氨基酸，但对于长链蛋白质，可能需要结合其他方法。

这种方法真正地实现了蛋白测序的自动化——只需让N端的氨基酸残基依次变成PTH-氨基酸掉落，再依次检测PTH-氨基酸的种类即可。

据此，也诞生了以Edman降解法为原理的氨基酸自动测序仪。虽然Edman降解法仅适用于20-30个AA长度的小肽，超过50AA后就极不准确，但用来测定将肽链酶解后各个小片段的序列还是十分准确高效的。

3、质谱

1）原理

质谱分析已成为蛋白质测序的强大工具，它利用蛋白质或肽的质量和电荷特性，通过质谱仪进行分析，以确定其氨基酸组成。