作为现代分子生物实验技术的基础，分子克隆技术在多个领域都有广泛的应用，从基因治疗到植物育种，可以说，它撑起了生物领域。
其中，无缝克隆技术是依赖于同源序列的基因克隆技术，具有简单、快速、高效的特点。通过重组酶的作用，能够将任意含有载体末端重叠区域的 DNA 片段重组至线性化载体上，不受酶切位点限制，载体自连背景极低。
目前应用较广泛的无缝克隆方法是 Gibson Assembly 和 In-Fusion Cloning。
不论是传统的酶切连接克隆方法还是无缝克隆这类新技术，如果要做基因表达和敲除，仍然逃避不了克隆基因片段这个步骤，打好相关的基础，掌握其中原理才能在各种状况出现时及时掌握并灵活应用。
而在这时候，SnapGene 无疑是所有从事相关研究工作者的强大助力。只要掌握了 SnapGene，不仅能让你在构建质粒时得心应手，更能让你对各种克隆原理了如指掌！
为了「偷懒」而研发的 SnapGene
SnapGene 软件的诞生是一名细胞生物学家的无奈之举。他发现由于克隆过程记录不完整，研究人员会浪费大量的精力来避免错误，为了解决这个问题，他汇集了一批科学家，软件工程师和产品开发人员研发出了这款软件。
SnapGene 包含了序列编辑和标记、质粒图谱构建、酶切位点分析、序列比对等多种功能，由于功能强大也被称为「分子生物学界的瑞士军刀」。
看似复杂，实则功能齐全的 Snapgene 软件界面
这里学霸君演示的软件版本为 SnapGene 7.2.1（Mac）。不同版本不同系统下的软件页面相差不大，均可适用。
操作界面中的顶部和侧面各有一个工具栏，底部是几个选项卡。
顶部工具栏包括：
「操作」选项中有一系列用于执行实验前模拟实验的工具，每个都有预选择的默认选项，以及自定义反应的选项，以满足所需操作要求。
「工具」选项中有一系列使用 BLAST 琼脂糖凝胶或序列比对来分析序列和验证结果的工具。
对于注释工具，请访问工具栏中的「酶」、「特性」或「引物」选项，每个选项都有创建、编辑和显示每种注释所需的工具。
侧工具栏从上至下依次是：显示酶切位点、显示注释的功能片段、显示引物、识别可翻译的片段、显示颜色、在 DNA 链上显示功能片段、显示功能片段的名称、显示位置、显示限行质粒图谱、测序结果序列对比。
设计引物不用自己想，交给 SnapGene 一键生成
首先需要准备表达载体序列与目的基因序列。（可以从 NCBI、文献等进行搜索）
在此，学霸君以大肠杆菌蛋白表达载体 pet28a 和目的基因序列 hyg 为例：
用 SnapGene 打开表达载体 pET28a 的质粒图谱。
根据实验将使用的无缝克隆试剂以及技术选择相应的选项，以 In-Fusion 为例。
依次在工具栏中点击：Actions-In-Fusion Cloning-Insert Fragment（这里以插入一个片段为例）。
光标放在载体的 MCS（多克隆位点）处，选择页面最下面一排的「Sequence」显示核苷酸序列以方便拖选（要注意酶切位点是否显示哦，如果光秃秃的就要按一下「侧工具栏」中第一个选项）。
选择线性化方式，这里使用双酶切线性化，并选择酶切位点。
注意：
要保证所选的限制性内切酶实验室里有或者买得到哦。
最好保证选择的两个酶切位点在载体上不要相邻，如若必须如此则在切载体时先切割对保护碱基要求高的位点，再切另一个位点，这样可以提高酶切效率。
当没有酶切位点可用时，也可以选择用 PCR 的方式将载体线性化。
选中需要切除的片段后，点击上方的第二个选项卡「Fragment」，选择含有拟插入序列的基因文件，选中需要插入的片段。
点击上方第三个选项卡，选择 PCR 引物选项，填入退火温度（一般为 60 度）以及 Overlap，并选择是否保留酶切位点后点击「Choose Primers」。
点击「Clone」，便能生成融合载体图谱以及插入片段的正向/反向引物。
最后，就到了我们的 double check 时间。
如这个例子里，由于后续实验目的是要纯化蛋白，则需要将 His 标签与蛋白融合。而点开侧工具栏中「显示可翻译片段」后，发现蛋白翻译并没有从 His 开始。
很简单，只需将光标点在需要添加碱基的地方，敲入一个「G」，就能顺利将两者一起翻译啦～（不要忘记引物里也要加上，点击该引物即可编辑）。
除此之外，还可以检查一下：软件生成的正反向引物 GC 含量（40%～60%）、尽可能确保引物 3』 端最后两个碱基是 C 和 G 的组合、正向和反向引物的 Tm 值相差在 5 度以内 ……
这些可能都是后续 PCR 以及重组是否能成功的关键所在哦。检查结束后，我们的引物就设计好咯，送去合成即可。
看了上述干货教程，你学会了吗？使用科研软件在于多探索，多研究，不要担心出错。每一次碰壁、错误都是宝贵的学习财富。有兴趣的同学可以登录 SnapGene 官网（https://www.snapgene.com/）下载 SnapGene 软件，或是生物学霸后台回复「SnapGene」获取下载链接。
欢迎留言分享你的 SnapGene 使用经验哦，也可以告诉我们你想学习的软件，学霸君也会在后续奉上更多的使用科研工具干货～
题图来源：图虫创意
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