开始之前我们先看一下标准流程
# 加载必要的库
library(Seurat)
library(harmony)
# 数据预处理与分析
subset_data %
Seurat::NormalizeData(verbose = FALSE) %>% # 归一化数据
FindVariableFeatures(selection.method = "vst", nfeatures = 2000) %>% # 选择2000个变异基因
ScaleData(verbose = FALSE) %>% # 数据缩放
RunPCA(npcs = 50, verbose = FALSE) # 主成分分析（PCA）
# Harmony批次效应校正
subset_data % RunHarmony("stim", plot_convergence = TRUE)
# 获取Harmony嵌入数据
harmony_embeddings
# 降维和可视化
dims = 1:30
subset_data %
RunUMAP(reduction = "harmony", dims = dims) %>% # 使用Harmony嵌入做UMAP
RunTSNE(reduction = "harmony", dims = dims) %>% # 使用Harmony嵌入做t-SNE
FindNeighbors(reduction = "harmony", dims = dims) %>%
Findclusters(reduction = "harmony", dims = dims)
# 可视化结果
DimPlot(subset_data, reduction = "umap") # UMAP可视化
DimPlot(subset_data, reduction = "tsne") # t-SNE可视化
# 如果你已经定义了细胞类型，可以用以下方式展示不同类型的细胞
DimPlot(subset_data, group.by = "cell_type") # 基于已有的细胞类型标签绘制图
详细解释
1.
数据归一化 (
NormalizeData
)
subset_data = subset_data %>%
Seurat::NormalizeData(verbose = FALSE)
-
目的
：数据归一化的目的是将每个细胞的基因表达值调整到同一尺度，消除测序深度（library size）对表达数据的影响。通常，基因表达数据会进行对数变换，以便更好地比较各个基因的表达水平。
-
使用的输入数据
：它使用的是
subset_data
对象中的原始基因表达矩阵（通常是原始的 RNA counts）。
-
结果
：
NormalizeData
函数会创建一个新的归一化数据集，结果存储在
subset_data
中。在
verbose = FALSE
时，函数不会输出过多的运行信息。
2.
选择可变基因 (
FindVariableFeatures
)
subset_data = subset_data %>%
FindVariableFeatures(selection.method = "vst", nfeatures = 2000)
-
目的
：选择在不同细胞之间变异性最大的基因，通常选择前 2000 个变异性最大的基因。这些基因常被用于后续分析，如降维和聚类。
-
使用的输入数据
：
它使用归一化后的数据（即上一步
NormalizeData
处理过的数据），通过计算每个基因在所有细胞中的变异性来选择最具代表性的基因。
-
结果
：
FindVariableFeatures
通过计算基因的变异性，选出变异性最大的 2000 个基因，并将这些基因的信息存储在
subset_data
的
@meta.data
中。
3.
数据缩放 (
ScaleData
)
subset_data = subset_data %>%
ScaleData(verbose = FALSE)
-
目的
：将选择的变异基因数据进行标准化，使得每个基因的均值为 0，标准差为 1。这样可以确保每个基因在降维（如 PCA）时具有相同的贡献，不会因为基因的表达水平差异过大而影响结果。
-
使用的输入数据
：它使用的是上一步选择的变异基因数据，通常是经过归一化的数据。
-
结果
：
ScaleData
处理后，每个基因的数据被缩放，结果存储在
subset_data
对象中。
4.
主成分分析 (PCA) (
RunPCA
)
subset_data = subset_data %>%
RunPCA(npcs = 50, verbose = FALSE)
-
目的
：主成分分析（PCA）是降维的一种方法，它通过计算数据中的主成分（PCs）来减少特征空间的维度。在这里，我们选择了前 50 个主成分（npcs = 50）。
-
使用的输入数据
：
它使用的是缩放后的数据（即
ScaleData
处理过的数据）。PCA 会基于这些数据计算出每个细胞在每个主成分上的投影。
-
结果
：PCA 结果被存储在
subset_data
对象中，作为一个新的维度数据，可以用于后续的降维和可视化步骤。
5.
绘制肘部图 (
ElbowPlot
)
ElbowPlot(subset_data, ndims = 50)
-
目的
：肘部图用来帮助选择适当的主成分数目，通常选择肘部（即误差变化急剧减缓的地方）之前的主成分数量作为分析的维度数。
-
使用的输入数据
：
它使用的是前一步的 PCA 结果（即
RunPCA
生成的主成分数据）。
-
结果
：肘部图会展示不同主成分数与方差解释度的关系，帮助你判断哪些主成分对数据变异贡献较大，通常选择那些方差解释度较高的主成分。
6.
绘制小提琴图 (
VlnPlot
)
VlnPlot(subset_data, features = c("nFeature_RNA", "nCount_RNA", "percent.mt"), ncol = 3)
-
目的
：通过小提琴图（violin plot）展示不同细胞的基因数目（nFeature_RNA）、转录本数目（nCount_RNA）以及线粒体基因的百分比（percent.mt）。这些指标常用于质量控制，帮助识别低质量细胞或过度激活的细胞。
-
使用的输入数据
：
它使用
subset_data
对象中的元数据（
@meta.data
）以及基因表达数据。
-
结果
：图形会显示这些不同特征在细胞中的分布情况，帮助你了解数据的质量。
7.
数据整合（Harmony）
library('harmony')
subset_data %
RunHarmony("stim", plot_convergence = TRUE)
-
目的
：使用 Harmony 方法整合批次效应（batch effects）或条件效应（如刺激 vs. 对照），使得整合后的数据不受这些效应的干扰。
stim
是数据中的一个元数据列，用来标记不同的实验条件（如实验组 vs. 对照组）。
-
使用的输入数据
：
它默认使用的是
subset_data
对象中的 PCA 结果（即
RunPCA
或其他降维方法的结果）
。
-
结果
：
RunHarmony
会基于所指定的元数据（在这里是
stim
）来消除批次效应或实验条件效应，生成新的“和谐”嵌入（harmony embeddings），它们存储在
subset_data
对象中。
8.
降维与可视化（UMAP 和 t-SNE）
subset_data %
RunUMAP(reduction = "harmony", dims = dims) %>%
RunTSNE(reduction = "harmony", dims = dims) %>%
FindNeighbors(reduction = "harmony", dims = dims)
-
目的
：使用 UMAP 和 t-SNE 进行非线性降维可视化。UMAP 和 t-SNE 都是常用于高维数据可视化的技术，通过将数据从高维空间降到 2D 或 3D 空间，便于观察细胞群体的分布。
FindNeighbors
则用于根据指定的维度（如前 30 个 Harmony 维度）计算细胞之间的相似性，生成邻居图。
-
使用的输入数据
：
RunUMAP、 RunTSNE使用的是 Harmony 处理过的数据（即
RunHarmony
的结果），并基于指定的维度（
dims
）进行降维。
-
结果
：生成的 UMAP 和 t-SNE 图将存储在
subset_data
对象中，帮助你直观地查看细胞在低维空间的分布。
9.
细胞聚类 (
FindClusters
)
subset_data = FindClusters(subset_data, resolution = 0.3)
