近
日，陕西师范大学杨鹏教授团队采用一种普遍适用的温度依赖性蛋白质聚集（TPA）策略，可以操纵蛋白质链的展开、松弛和重组，从而实现淀粉样蛋白的3D打印。内部二硫键的破坏诱导蛋白质的展开和松弛，导致通过作为主要交联点的链缠结形成无定形蛋白质溶胶。这些松弛的蛋白质链通过构象转变进一步聚集，在高温下引发富含β-折叠结构的类淀粉样蛋白聚集，形成以β-折叠纳米晶体作为二次交联点的蛋白质凝胶。这种凝胶有利于稳定且精确地基于挤出的具有分层有序结构的蛋白质支架的 3D 打印。这种 3D打印蛋白质支架的生物医学潜力通过其生物矿化能力以及随后使用大鼠颅骨缺损模型在骨组织再生中的应用得到了初步验证。该策略展示了一种在体外可控蛋白质结构聚集的简便方法，并且在基于蛋白质的支架领域具有巨大潜力。
相关成果以“3D Printing of Proteins Via Temperature‐Dependent Amyloid Aggregation”为题，发表在《
Advanced Functional Materials
》(期刊号：Adv. Funct. Mater. 2024, 2420569 IF=18.5)上
。
图
1. 通过MD模拟研究了不同温度下
溶菌酶
的聚集过程。a) MD快照显示了高温下不同时间点未折叠溶菌酶的聚集状态。b) 高温下200 ns时聚集的溶菌酶分子之间的分子间相互作用。c–g) 静电相互作用力 (c)、氢键数量 (d)、亲水性和疏水性氨基酸分布 (200 ns) (e)、回转半径 (Rg) (f) 和 β-折叠百分比 ( g) 在模拟溶菌酶系统中于 298 和 333 K 下进行分析。
图
2. 通过 TPA 策略进行蛋白质构象转变。a)通过链缠结制备PTL溶胶(i)和通过β-片层纳米晶体制备PTL凝胶(ii)的示意图。b,c)
PTL
溶液在 25 和 50 °C 下的 NPM 和
ThT
荧光。d,e) 不同时间天然溶菌酶、PTL sol 和 PTL gel 的 CD 谱以及相应的 BeStSel 二级结构定量分析。f) PTL 溶胶和 PTL 凝胶 FTIR 表征中酰胺 I 区域的解卷积。g,h) PTL sol 和 PTL gel 的散点图 (I≈q) (g)、Kratky 图 (I·q2≈q)（插入图像）以及相应的 PDDF 数据 (h)。i) 在不同温度和浓度下产生的蛋白质材料的相图。j–m) TEM (j)、高分辨率 TEM (k,l)、PTL 凝胶相应的 SAED 图像 (m)。上述情况中的凝胶是用溶菌酶（20 wt.%）、TCEP（50 mm，pH 2）在 50 °C 下制备的。
图
3. PTL 凝胶机械性能的增强和表征。a)采用模压法制备整体蛋白凝胶的示意图。b–d) 三种蛋白质凝胶的形成机制示意图：通过 β 片层结晶和链缠结形成 PTL 凝胶 (b)，通过钙离子交联形成 PTLC 凝胶 (c)，通过戊二醛化学交联形成 PTLG 凝胶 ( d). e-g）分别是 PTL 凝胶（e）、PTLC 水凝胶（f）和 PTLG 水凝胶（g）相应的横截面 SEM 图像和内部 3D 模型构建。h) PTL凝胶、PTLC凝胶和PTLG凝胶在连续压缩-释放循环测试后的应力-应变曲线。i,j) PTL凝胶、PTLC凝胶和PTLG凝胶在不同方向（平行和垂直）10次压缩循环后的杨氏模量（i）和能量耗散密度（j）。上述情况中的凝胶是用溶菌酶（20 wt.%）、TCEP（50 mm，pH 2）在 50 °C 下制备的。
图
4. 3D 打印 PTL 支架的构建。a）通过TPA策略3D打印PTL支架的示意图。各种 3D 打印器官支架 b) 和偏光显微镜下的光学图像显示，当偏振器平行于支架排列时，透射率最小，而在 c) a -45° 和 45° 时透射率最大。d) PTL 水凝胶的储能模量 (G') 和损耗模量 (G'') 与剪切应力的函数关系。e) PTL 水凝胶在剪切速率从 10−1 到 103 s−1 范围内的粘度变化。f) 相图显示了 PTL 凝胶在不同剪切速率和粘度下的适印性。该凝胶表现出适印性、形状保真度较差和不可适印性的区域。使用的喷嘴直径为0.26毫米。上述情况中的凝胶是用蛋白质 (25 wt.%)、TCEP (50 mm, pH 2) 在 50 °C 下制备的。g) 使用不同喷嘴尺寸（22-30 G）制造的 3D 打印水凝胶晶格的光学图像。h,i) PTL 支架的 SEM 图像，显示表面 (h) 和横截面结构 (i)。j) 利用 TPA 策略进行蛋白质的通用 3D 打印。如 LYS、
BSA
、HSA、OVA、Fig、LF、CT 和 HB。方格的厚度为0.42mm*6。上述情况中的凝胶是用蛋白质 (30 wt.%)、TCEP (50 mm, pH 2) 在 50 °C 下制备的。
图
5. 分层有序 3D 打印支架的生物矿化。a) PTL支架诱导生物矿化的示意图。b,c) HAp@PTLC (b) 和 HAp@PTLG 支架 (c) 表面形貌的 SEM 图像。d) 蛋白质支架表面形成的 HAp 晶体的 TEM 图像。e) HAp@PTLC 表面的 EDX 映射。f–h) PTL、HAp@PTLC 和 HAp@PTLG 支架的 XRD (f)、拉曼 (g) 和 FTIR (h) 光谱。上述情况中的支架是用蛋白质（20 wt.%）、TCEP（50 mm，pH 2）在 50 °C 下制备的。
图6
. 体内颅骨骨再生的评价。a) 植入前后颅骨的动物测试示意图。b) 在体内植入矿化蛋白质支架 1-6 个月后，通过微型 CT 获得的代表性 3D 重建图像。c–f) 显微 CT 数据的定量分析：BV/TV，Tb。氮，铽。钍和铽。分别为 Sp（* 代表 p < 0.05）。g) 通过 H&E 和 Masson 三色染色对 1-6 个月时的骨形成进行组织学分析。（HB：宿主骨；NB：新骨；M：不同材料的原始位置）。h,i) 矿化蛋白质支架的组织学毒性 (h) 和血液生化分析 (i)。
总之，作者开创了一种 TPA 策略来实现类淀粉样蛋白材料的 3D 打印，通过调节二级结构来实现受控的蛋白质组装和有序的分子排列
。通过破坏溶菌酶中的二硫键来操纵未折叠的蛋白质链，我们实现了蛋白质支架的可控且稳定的打印，其有序结构类似于天然蛋白质材料中的有序结构。通过分子动力学模拟揭示并经过实验验证，不同温度下不同的聚集行为和机制证明了对蛋白质构象转变的热力学控制。由此产生的 PTL 水凝胶具有卓越的剪切稀化特性，可确保基于挤出的 3D 打印准确稳定。打印支架内分子链和结晶区域的方向有助于其分层有序结构，类似于天然蜘蛛丝中发现的β-折叠晶体结构。这种高度有序的晶体结构赋予凝胶强度、韧性和结构稳定性，显著增强其拉伸强度和弹性，并使其在受到外力时恢复到原来的形状。此外，通过原位生物矿化在支架表面形成生物活性HAp涂层的能力显着促进受损大鼠头骨的骨再生。该策略的普适性也通过其在各种蛋白质上的应用得到了证明。这项研究不仅扩展了蛋白质材料的加工技术，而且凸显了利用定制的蛋白质构象转变和有组织的聚集来开发先进的基于蛋白质的生物医学材料的潜力。TPA 战略开辟了为各种生物医学应用创建定制功能性生物材料的新途径。目前，使用TPA策略制备的蛋白质水凝胶表现出较差的机械性能，通常需要离子或化学交联。蛋白质纯度和成本也被认为是限制该策略广泛应用的关键因素。因此，未来的工作将集中于将该策略应用于更具成本效益的植物蛋白，并改善凝胶的机械性能，例如通过调节β-折叠结晶区域的大小和有序排列。
