蛋白纯化：毕赤酵母蛋白表达系统全解析

在生命科学研究里，重组蛋白的真核高效表达和生产可是相当重要的一环。在众多用来生产重组蛋白的 “小工厂”—— 宿主系统中，毕赤酵母，也有人叫它甲醇酵母，凭借自身独特的优势，在蛋白质表达领域站稳了脚跟。

一、毕赤酵母蛋白表达系统的特点

（一）优点多多

1. 基因表达效率高 ：毕赤酵母有个 “得力助手”—— 强启动子，像常用的 AOX1（酒精氧化酶 1 基因启动子），只要遇到甲醇这种外源诱导剂，就会被迅速激活，然后使劲儿驱动目标基因表达，让目标蛋白大量产生。而且，通过调整甲醇的添加量等培养条件，就能灵活控制目标蛋白的产量。
2. 擅长翻译后修饰 ：和大肠杆菌这些原核系统不同，毕赤酵母进行 N - 连接糖基化修饰的方式更接近哺乳动物细胞。这对一些治疗性蛋白来说可太重要了，只有经过这样的修饰，它们才能正常发挥作用。除了糖基化，毕赤酵母还能给蛋白进行磷酸化等其他修饰，让蛋白的质量更好，功能也更强大。
3. 操作简单还省钱 ：比起哺乳动物细胞系，毕赤酵母繁殖速度快得惊人，短时间内就能让细胞数量变得很多。它不挑吃的，在简单的合成或半合成培养基上就能长得很好，这样一来，生产成本降低了，后续处理也更简单。
4. 适用范围广泛 ：毕赤酵母有各种各样的质粒载体可以选择，不管是什么类型的基因，都能找到合适的载体 “住进去”。而且，不管是在实验室小规模试试，还是用大规模发酵罐进行生产，它都能出色完成任务。

（二）存在的缺点

1. 转化需要大量质粒 DNA ：毕赤酵母在转化的时候比较 “贪心”，它的感受态细胞需要大量（μg 水平）的质粒 DNA 才能完成转化。相比之下，大肠杆菌每微克 DNA 能转化出的菌体数量可比它多多了。
2. 依赖甲醇且浓度要求苛刻 ：毕赤酵母生产蛋白质全靠消耗甲醇。实验发现，至少得有 0.5% 浓度的甲醇，才能启动重组蛋白的表达。但要是甲醇浓度超过 5%，就会对细胞产生毒害，严重的话生产过程都得被迫停止。
3. 选择性标记有限 ：毕赤酵母转化时能用的选择性标记不多，主要也就是 his4、arg4 和 Shble（用来抗 Zeocin 抗生素）这几种。
4. 容易污染和降解蛋白 ：毕赤酵母的表达培养基很容易被腐生细菌和真菌盯上，这些 “不速之客” 分泌的蛋白酶会把目标蛋白降解掉，影响蛋白的产量和质量。而且，有时候宿主细胞自己的蛋白酶也会 “捣乱”，破坏产生的蛋白质。不过现在已经有了新办法，像 SMD1163、SMD1165 等新菌株，通过敲除编码蛋白酶 A（pep4）和蛋白酶 B（prb1）的基因，成功解决了这个问题。
5. 启动子可持续性有问题 ：虽然 PGAP 和 PAOX1 启动子有不少优点，可它们在持续表达方面存在缺陷。

二、毕赤酵母蛋白表达系统实验方法

（一）基因克隆

1. 构建表达载体 ：要想成功表达蛋白质，构建一个好的表达载体是关键的第一步。一个理想的表达载体得有这几个重要部分：5′端要有启动子序列，最常用的就是 AOX1，它能在甲醇的诱导下被激活；3′端得有转录终止序列，这对 mRNA 的加工和多聚腺苷酸化很重要；还得有单或多克隆位点，方便把目标基因准确地插进去。另外，载体最好能在大肠杆菌和毕赤酵母这两种不同宿主里都能复制。为了筛选方便，载体上一般还会带上抗性标记基因，像 Kan（遗传霉素）、Shble（Zeocin）这些。

   

   图1 毕赤酵母基因组中的交叉互换重组现象

   表2：用于生产分泌蛋白的常见 Pichia pastoris 表达载体

   

2. 克隆目标基因 ：选好目标基因后，就要把它克隆到之前构建好的表达载体里。这一步包括扩增目标基因片段，检查它是否正确，然后把它插入到载体的多克隆位点。为了让后续整合更顺利，克隆后的载体要用合适的限制性内切酶，比如 Sac I、PmeI 这些进行线性化处理。

（二）转化

1. 制备感受态细胞并电穿孔 ：线性化后的载体要进入感受态的毕赤酵母细胞里，这通常会用电穿孔法。简单来说，就是利用电脉冲在细胞膜上 “开个小口子”，让外源 DNA 趁机溜进去。
2. 基因组整合 ：载体进入细胞后，会发生同源重组现象，外源 DNA 序列就会整合到毕赤酵母的染色体上。这个重组一般发生在载体的 5′PAOX1 区域和宿主细胞 AOX1 基因的同源序列之间。大多数时候，只会发生一次交叉事件，但也有 1% - 10% 的情况，会出现多次插入。

（三）表达筛选

1. 测试不同菌株 ：完成整合后，要对不同的转化子进行初步测试，看看哪个菌株最适合表达目标基因。这时候可以通过检测目标蛋白的表达水平，来判断各个候选菌株的表现。
2. 优化表达条件 ：找到最适合的菌株后，接下来就要优化表达条件。这包括调整培养基成分、温度、pH 值等，其中甲醇浓度尤其重要，因为它是激活 AOX1 启动子的诱导剂。精确控制甲醇的供给速率才能保证高水平表达。生产重组蛋白至少需要 0.5% 浓度的甲醇，想要蛋白完全表达，浓度得控制在 2 - 2.5%（wt/vol）。甲醇浓度要是超过 5%，对细胞有毒，会让甲醛和过氧化氢积累，最后细胞就死了。要是甲醇浓度太低，又会导致异源蛋白质被蛋白酶降解，产量也就降低了。另外，毕赤酵母生长的适宜温度是 28 - 30°C，超过 32°C，就可能对蛋白质表达诱导产生不利影响，严重的话细胞也会死亡。
   表3：适合毕赤酵母作为一种来生产重组生物分子的宿主

   

3. 选择表达方式 ：根据实际应用需求，可以选择让目标蛋白分泌到培养基里，或者留在细胞内部。如果是分泌型表达，可能还得优化信号肽序列，这样能提高分泌效率，减少蛋白在细胞内聚集。要是胞内表达，就要多想想怎么把目标蛋白高效地回收和纯化出来。
4. 评估表达产物质量 ：可以用 SDS - PAGE、Western blotting 这些常见方法，检测目标蛋白的分子量和纯度。同时，结合功能测试，比如测测酶活性，来看看它的生物学活性怎么样。

三、毕赤酵母蛋白表达系统展望

1. 开发新型调控元件 ：利用像 CRISPR/Cas9 这样厉害的基因编辑工具，可以创造出更多不同的启动子和终止子，这样就能更精准地调控基因表达。还能引入人工合成的响应元件，让毕赤酵母在遇到特定刺激时，能自动启动或关闭目标基因的表达，变得更灵活、适应性更强。
2. 强化翻译后修饰能力 ：通过引入新的修饰酶，或者改造现有的修饰路径，毕赤酵母就能更好地模仿哺乳动物细胞的复杂修饰过程，适用范围也会更广。另外，利用代谢工程调整细胞内的代谢流，也能间接影响蛋白质的修饰，让最终产品的质量更上一层楼。
3. 推动工业化应用 ：在现有的基础上，进一步优化发酵工艺，降低生产成本，提高产量，给生物医药行业提供更多优质的原材料。同时，加强和其他生物技术平台合作，打造完整的产业链，让科研成果更快地变成实际生产力。

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