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双氢青蒿素自微乳给药系统的制备及其评价

中草药杂志社 · 公众号 · 药品 · 2021-03-12 13:12

正文

摘要：目的研究双氢青蒿素（ dihydroartemisinin ， DHA ）自微乳给药系统（ self-microemulsiondrug delivery system ， SMEDDS ）（ DHA-SMEDDS ）的处方与制备工艺，并对其进行评价。方法通过溶解度实验、油相与乳化剂和助乳化剂配伍实验及伪三元相图的绘制，筛选 DHA-SMEDDS 的处方组成；以平均粒径、载药量为评价指标，采用星点设计 - 效应面法优化处方，并对 DHA-SMEDDS 的理化性质、初步稳定性进行评价。考察 DHA-SMEDDS 在马丁达比犬肾上皮 MDCK 细胞模型中促渗机制。结果优化后的 DHA-SMEDDS 处方中油相为辛癸酸甘油酯（ 15% ）、乳化剂为聚氧乙烯 40 蓖麻油（ 46.4% ）、混合助乳化剂为无水乙醇（ 24.12% ）和聚乙二醇 400 （ 14.48% ）。所得自微乳外观均一透明，自乳化后平均粒径（ 24.55 ± 0.18 ） nm ，多分散性指数（ PDI ）为 0.092 ± 0.028 ，电位为（ −3.16 ± 0.14 ） mV ，载药量为（ 9.64 ± 0.01 ） mg/g ，包封率为（ 99.67 ± 0.10 ） % ，乳化时间为（ 13.90 ± 0.10 ） s 。初步稳定性实验表明， DHA-SMEDDS 应常温避光保存。 DHA-SMEDDS 可以打开细胞间的紧密连接蛋白，降低细胞膜电位，增加细胞通透性，增强 Ca ²⁺ -ATP 酶活性。结论 DHA-SMEDDS 制备工艺简单，外观良好，乳化效率高，有望提高 DHA 的口服生物利用度。

青蒿素提取分离自黄花蒿 Artemisia annua L. ，是一种抗疟药物，其特点有疗效高、毒性较小等 ^[1] 。双氢青蒿素（ dihydroartemisinin ， DHA ）是由四氢硼钠还原青蒿素而得，其结构特征为独特的过氧桥，具有多种优点，如药效高、毒性低、在体内吸收快、排泄和代谢迅速、分布广。此外， DHA 的抗疟作用是青蒿素的 4 ～ 8 倍 ^[2] 。有研究表明， DHA 具有抗疟、抗肿瘤、抗炎、抗肺纤维化以及抗其他寄生虫等药理作用 ^[3-4] 。但 DHA 在水中溶解度较低，其口服生物利用度会受到一定影响，其制剂的开发也受到限制。近年来，研究人员采用增溶技术，如脂质体 ^[5] 、环糊精包合物 ^[6] 等改善 DHA 的溶解度，但其制备工艺复杂，工业化技术要求较高。因此，为进一步提高 DHA 的溶解度，应开发制备工艺简单、易于产业化的 DHA 新剂型。

自微乳给药系统（ self-microemulsiondrug delivery system ， SMEDDS ）是药物、天然或合成油、乳化剂和助乳化剂的均匀混合体系 ^[7-8] 。 SMEDDS 将疏水性药物引入油相体系，在水介质中适度搅拌和适当稀释后形成 O/W 型的乳剂，可以大大提高疏水性药物口服生物利用度 ^[9-12] 。此外， SMEDDS 还具有较高的生物相容性、稳定性、控释性 ^[13] 。近年来，伪三元相图 ^[14-15] 作为研究成乳区域的基础工具，操作简单，常与预测效果更好的星点设计 - 效应面法（ CCD-RSM ） ^[16-17] 联合用于处方筛选。

因此，为解决 DHA 溶解度较差、生物利用度较低等问题，本实验通过绘制伪三元相图筛选处方中辅料（油相、乳化剂和助乳化剂）的比例，采用 CCD-RSM 确定处方最佳比例，制备 DHA 自微乳（ DHA-SMEDDS ），进行评价，为进一步研究与开发 DHA 的新剂型提供依据，实现提高药物溶解度、增加口服生物利用度、改善胃肠道吸收的目的 ^[18] 。

1 材料

1.1 细胞株

犬肾 MDCK 细胞，天津药物研究院有限公司惠赠。

1.2 试药

DHA 原料药，昆药集团重庆武陵山制药有限公司，批号 C01120200501 ，质量分数 98.2% ； DHA 对照品，中国食品药品检定研究院，批号 100184- 201403 ，质量分数为 99.8% ；甲醇、乙腈、无水乙醇，色谱纯，天津市康科德科技有限公司；盐酸、磷酸二氢钾，天津市风船化学试剂科技有限公司；磷酸氢二钾，天津市光复科技有限公司；氢氧化钠，天津市凯信化学工业有限公司；正辛醇、聚乙二醇 400 （ PEG400 ）、聚乙二醇 -12- 羟基硬脂酸酯（ HS15 ）、中链甘油三酸酯 Miglyol 812N 、蓖麻油聚烃氧酯（ EL35 ）、聚氧乙烯 40 蓖麻油（ RH40 ），北京凤礼精求商贸有限公司；屈臣氏纯净水； 1,2- 丙二醇，第二军医大学药学系合成药物研究所；辛癸酸甘油酯（ MCT ），上海佑创实业有限公司；油酸乙酯，国药集团化学试剂有限公司；肉豆蔻酸异丙酯（ IPM ），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高糖 DMEM 培养基、胎牛血清（ FBS ）、青霉素 - 链霉素、 PBS 缓冲液、胰蛋白酶，美国 Gibco 公司；二甲基亚砜（ DMSO ），美国 Sigma 公司；冰冻 4% 多聚甲醛溶液、 DAPI 工作液（ 1 mg/mL ），北京索莱宝科技有限公司；山羊血清工作液，北京康为世纪生物科技有限公司；兔抗 ZO-1 抗体，美国 InvitrogenCorporation 公司； TritonX-100 ，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司； Acti-stain 488 phalloidin 荧光标记鬼笔环肽，美国 Cytoskeleton 公司；异硫氰酸荧光素（ FITC ）标记山羊抗兔 IgG ，武汉谷歌生物科技有限公司； DiBAC4 （ 3 ），美国 Life Technologies 公司； Ca ²⁺ -ATP 酶、 BCA 蛋白定量试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器

HPLC Agilent 1260 液相色谱仪，美国 Agilent 公司； THZ-92C 气浴恒温振摇器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂； BS224S 型电子天平， Sartorius 公司； SB-3200DTN 超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司； TG20-WS 型高速离心机，长沙维尔康湘鹰离心机有限公司； DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器，天津赛盟实验仪器有限公司； NANO-ZS90 型马尔文粒度分析仪，英国 Malvern 公司； HT7700 透射电子显微镜（ TEM ），日本日立公司； Series Ⅱ 型二氧化碳培养箱、 Multiskan Go 全自动酶标仪，美国 Thermo 公司；超净工作台， Heal Force ； CKX-41 型倒置显微镜，日本 Olympus 公司； Scientz-IID 型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；细胞计数板，上海市求精生化试剂仪器有限公司； FACS Aira Ⅱ 型流式细胞仪，美国 BD 公司； IX73 型倒置荧光显微镜，日本奥利巴斯公司； TDL80-2B 型台式离心机，上海安亭科学仪器厂； 6 孔细胞培养板、 96 孔细胞培养板，美国 Corming 公司；激光共聚焦培养皿，上海晶安生物科技有限公司。

2 方法与结果

2.1 DHA-SMEDDS 的制备

固定油相、乳化剂与混合助乳化剂总质量为 10 g ，称取一定量的油相、乳化剂及混合助乳化剂于茄形瓶中， 40 ℃下 300 r/min 磁力搅拌 30 min ，得空白自微乳。于 5 g 空白自微乳中精密加入 50 mg DHA ， 40 ℃磁力搅拌 1 h ，得到 DHA-SMEDDS 。

2.2 DHA 的含量测定

2.2.1 色谱条件色谱柱为 Reprosil-Pur Basic C ₁₈ 柱（ 250 mm × 4.6 mm ， 5 μm ）；流动相为乙腈 - 水；梯度洗脱： 0 ～ 25 min ， 40% 乙腈； 25 ～ 40 min ， 40% ～ 70% 乙腈； 40 ～ 40.1 min ， 70% ～ 40% 乙腈； 40.1 ～ 50 min ， 40% 乙腈；检测波长 216 nm ；柱温 25 ℃；体积流量 1.0 mL/min ；进样量 20 μL 。

2.2.2 对照品储备液配制精密量取适量 DHA 对照品，用甲醇溶解配制成质量浓度为 2.140 8 mg/mL 的对照品储备液。

2.2.3 对照品溶液配制精密吸取“ 2.2.2 ”项下对照品储备液 2.5 mL 于 10 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为 535.2 μg/mL 的对照品溶液。

2.2.4 供试品溶液配制精密量取 DHA-SMEDDS 0.5 g 于 10 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声 30 min ，冷却至室温后加甲醇稀释至刻度，摇匀， 0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液得到供试品溶液。同法制备 SMEDDS 空白对照溶液。

2.2.5 专属性考察分别取 SMEDDS 空白对照溶液、 DHA 对照品溶液、 DHA-SMEDDS 供试品溶液各 20 μL ，按照“ 2.2.1 ”项下色谱条件进行测定，并记录图谱。专属性实验表明， DHA 呈现 2 个色谱峰，分别为 α-DHA 和 β-DHA ，实验样品不干扰 DHA 的测定，色谱图见图 1 。

2.2.6 线性关系考察精密吸取“ 2.2.2 ”项下对照品储备液 0.1 、 0.5 、 1.0 、 2.5 、 3.0 、 5.0 mL 于 5 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别得到质量浓度为 0.042 8 、 0.214 1 、 0.428 2 、 1.070 4 、 1.284 5 、 2.140 8 mg/mL 的系列对照品溶液。精密吸取上述系列对照品溶液，按照“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，以 DHA 2 个色谱峰的峰面积和为纵坐标（ Y ），其质量浓度（ C ）为横坐标（ X ）作线性回归，得到回归方程 Y ＝ 503.24 X ＋ 1.642 9 ， r ＝ 0.999 9 。结果表明 DHA 在 42.8 ～ 2 140.8 μg/mL 线性关系良好。

2.2.7 精密度考察精密吸取“ 2.2.3 ”项下对照品溶液，按照“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定，连续测定 6 次，记录 DHA 2 个色谱峰峰面积和。经计算， DHA 2 个色谱峰峰面积和 RSD 为 0.23% ，结果表明仪器精密度良好。

2.2.8 重复性考察按“ 2.2.4 ”项方法制备供试品溶液 6 份，按“ 2.2.1 ”项下色谱条件连续进样测定 6 次，记录 DHA 2 个色谱峰峰面积和。经计算， DHA 2 个色谱峰峰面积和 RSD 为 0.36% ，结果表明该方法重复性良好。

2.2.9 稳定性考察精密吸取“ 2.2.4 ”项下适量的供试品溶液，分别于 0 、 8 、 10 、 12 、 21 、 24 h ，按“ 2.2.1 ”项下色谱条件测定并记录 DHA 2 个色谱峰峰面积和。 DHA-SMEDDS 供试品溶液的 DHA 2 个色谱峰峰面积和的 RSD 为 0.43% ，结果表明 DHA- SMEDDS 供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.2.10 加样回收率考察精密量取已知质量分数的 DHA-SMEDDS 9 份，每份 0.25 g ，置于 10 mL 量瓶中，分为 3 组，采用加样回收法，分别精密添加相当于供试品溶液中 DHA 质量分数的 80% 、 100% 、 120% 的 DHA 对照品各 3 份，加甲醇适量，超声 30 min ，冷却至室温后加甲醇稀释至刻度，摇匀， 0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液按“ 2.2.1 ”项下色谱条件进样测定并计算加样回收率。结果表明， DHA 的平均加样回收率为 100.12% ， RSD 为 1.79% 。回收率符合要求。

2.3 不同溶液中 DHA 平衡溶解度的测定

取过量的 DHA 原料药于 10 mL 具塞离心管中，分别加入水、 0.1 mol/L 盐酸以及不同 pH 值（ 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 、 5.8 、 6.0 、 6.8 、 7.4 ）的磷酸盐缓冲液（ PBS ），放入 37 ℃气浴恒温振摇器中， 110 r/min 振摇 24 h ，取出后用 0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液用甲醇稀释适宜的倍数，滤过，按照“ 2.2.1 ”项下色谱条件，精密吸取 20µL ，测定，记录 DHA 2 个色谱峰峰面积和，计算其平衡溶解度。实验结果显示， DHA 在 0.1 mol/L 盐酸、不同 pH 值（ 2.0 、 3.0 、 4.0 、 5.0 、 5.8 、 6.0 、 6.8 、 7.4 ）的 PBS 和水中的平衡溶解度分别为 120.4 、 168.9 、 167.0 、 167.8 、 150.6 、 141.1 、 125.8 、 112.7 、 46.8 、 148.1 μg/mL ，见表 1 。

2.4 不同溶液中 DHA 的表观油水分配系数（ P ）的测定

取 DHA 适量，溶于 25 mL 水饱和的正辛醇中，用甲醇稀释至标准曲线范围内后，滤过，按照“ 2.2.1 ”项下色谱条件，精密吸取 20 μL ，测定，记录 DHA 2 个色谱峰峰面积和，计算其初始质量浓度（ C ₀ ）为 4.198 7 mg/mL 。分别精密吸取上述正辛醇溶液各 2 mL ，共 5 份，置于 10 mL 离心管中，分别加入正辛醇饱和的水相（水、 0.1 mol/L 的盐酸溶液以及 pH 5.8 、 6.8 、 7.4 的 PBS ）各 2 mL ，放入气浴恒温振摇器中，在 37 ℃下， 110 r/min 振荡 24 h ，取出， 3500 r/min 离心 10 min ，静置分层，精密吸取上层正辛醇相 1 mL 至 5 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，按照“ 2.2.1 ”项下色谱条件，精密吸取 20 µL ，测定，记录 DHA 2 个色谱峰峰面积和，外标法计算其质量浓度（ C _油），进而计算 DHA 的 P ，计算公式为 P ＝ C _油 /( C ₀ － C _油 ) 。

实验结果（表 2 ）显示， DHA 在 0.1 mol/L 盐酸， pH 5.8 、 6.8 、 7.4 的 PBS 以及水中的 P 的 lg P 值均大于 1 ，提示药物的脂溶性较好。

2.5 DHA-SMEDDS 处方筛选

2.5.1 DHA 在不同辅料中的饱和溶解度试验称取过量的 DHA 原料药于 10 mL 具塞离心管中，分别加入不同的油相（ Miglyol 812N 、橄榄油、 MCT 、 IPM 和油酸乙酯）和助乳化剂（无水乙醇、 1,2- 丙二醇和 PEG400 ）各 10 g ，涡旋混匀， 40 ℃、 110 r/min 恒温振荡 24 h 。达到平衡后， 10 000 r/min 离心 10 min ，吸取适量的上清液并用 0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液用甲醇稀释至适当质量浓度，滤过，按照“ 2.2.1 ”项下色谱条件测定续滤液中 DHA 的含量。计算 DHA 在不同油相和助乳化剂中的溶解度。结果显示， DHA 在不同油相中的饱和溶解度大小依次为 Miglyol 812N ＞ MCT ＞橄榄油；在助乳化剂中的饱和溶解度大小依次为无水乙醇＞ PEG 400 ＞丙二醇。 DHA 在 Miglyol 812N 和 MCT 溶解度较好，均可用作油相，考虑到 MCT 成本较低，易于获得，故选用溶解度较高的 MCT 作为油相。 DHA 在无水乙醇和 PEG400 溶解度较好，均可用作助乳化剂。结果见表 3 。

2.5.2 乳化剂的筛选为了进一步考察辅料的相容性，筛选出乳化效果好的乳化剂，分别将油相与 RH40 、 EL35 、 HS15 按 1 ∶ 2 、 1 ∶ 1.5 、 1 ∶ 1 、 1.5 ∶ 1 、 2 ∶ 1 的比例在 40 ℃磁力搅拌充分混匀后观察其在纯化水中的分散情况，取适量上述基质，用纯化水稀释适当的倍数，轻轻振摇使其充分乳化，观察自微乳液的情况，从而选出乳化效果较好的乳化剂。

将自乳化情况按照以下 3 个级别进行评定：（ a ）溶液透明澄清，无色或者淡蓝色；（ b ）溶液略浑浊，显蓝白色乳光；（ c ）不透明黏稠液体 ^[19] 。实验结果表明：当 MCT 与 RH40 的比例为 1 ∶ 2 、 1 ∶ 1.5 、 1 ∶ 1 、 1.5 ∶ 1 、 2 ∶ 1 时，自乳化情况分别为 a 、 a 、 a 、 b 和 b ；当 MCT 与 EL35 的比例为 1 ∶ 2 时，自乳化情况为 a ，当其比例为 1 ∶ 1.5 、 1 ∶ 1 、 1.5 ∶ 1 时，自乳化情况均为 b ，当比例为 2 ∶ 1 时，自乳化情况为 c ； MCT 与 HS15 配伍时，乳化情况与 EL35 相同。考虑到乳化剂具有较低的毒性，在制备 SMEDDS 时应尽可能少的使用乳化剂，因此选择用量少且乳化效果好的 RH40 为乳化剂。

2.5.3 助乳化剂的考察采用 PEG400 为助乳化剂，先固定油相与乳化剂的比例为 1 ∶ 2 ，考察油相与 PEG400 配比为 2 ∶ 8 、 2 ∶ 4 、 2 ∶ 2 、 4 ∶ 2 、 8 ∶ 2 时在 40 ℃磁力搅拌充分混匀后观察其在纯化水中的分散情况，取适量上述基质，用纯化水稀释适当的倍数，轻轻振摇使其充分乳化，观察自微乳液是否澄清，以及 SMEDDS 在 24 h 内是否出现分层情况。评级方法同“ 2.5.2 ”项。实验结果表明，以上比例基质的自乳化情况均为 a ，但 SMEDDS 经放置后， 24 h 内出现分层现象。为了增加 SMEDDS 的稳定性、提高载药量，故加入适量的无水乙醇，制成混合助乳化剂。

2.5.4 混合助乳化剂比例的考察为确定混合助乳化剂比例，先固定油相、乳化剂、混合助乳化剂的比例为 2 ∶ 4 ∶ 4 ，考察 PEG400 与无水乙醇的比例分别为 3 ∶ 1 、 3 ∶ 5 、 3 ∶ 9 时，在 40 ℃磁力搅拌，充分混匀后观察其在纯化水中的分散情况，取适量上述基质，用纯化水稀释适当的倍数，轻轻振摇，使其充分乳化，观察自微乳液是否澄清，以及 SMEDDS 在 24 h 内是否出现分层情况。评级方法同“ 2.5.2 ”项。实验结果表明， PEG400 与无水乙醇的比例为 3 ∶ 9 、 3 ∶ 1 时，自乳化情况均为 a ，但两者配比为 3 ∶ 1 时 SMEDDS 经放置后， 24 h 内出现分层现象；而当 PEG400 与无水乙醇的比例为 3 ∶ 5 时， SMEDDS 乳化后的乳液澄清，乳化效果好且在 24 h 内不会出现分层现象。因此，确定混合助乳化剂中 PEG400 与无水乙醇的比例为 3 ∶ 5 。

2.5.5 伪三元相图的绘制将乳化剂与混合助乳化剂按照质量比（ K _m ）为 1 ∶ 9 、 2 ∶ 8 、 3 ∶ 7 、 4 ∶ 6 、 5 ∶ 5 、 6 ∶ 4 、 7 ∶ 3 、 8 ∶ 2 、 9 ∶ 1 混合后，再与油相按照比例为 1 ∶ 9 ～ 9 ∶ 1 进行混合，固定总量为 5 g ，分别称取相应的 MCT 、 RH40 和混合助乳化剂（ PEG400 和无水乙醇）， 40 ℃水浴磁力搅拌混合 30 min ，形成均匀透明状液体，称取 0.1 g 空白自微乳加纯化水稀释 100 倍，观察 SMEDDS 的乳化情况，以及在 24 h 内是否发生分层。选取自乳化后的溶液透明澄清，呈现无色或者淡蓝色的成乳区域，将伪三元相图的 3 个顶点设置为 MCT 、 RH40 、混合助乳化剂，使用 Origin 2018 绘制空白 SMEDDS 的伪三元相图，确定有效自微乳化区域。由图 2 可知，当油相、乳化剂和混合助乳化剂分别为 MCT 、 RH40 、 PEG400 与无水乙醇（ 3 ∶ 5 ）时，各相所占比例分别为 10% ～ 30% 、 27% ～ 81% 、 7% ～ 63% 。所筛选的 DHA 空白自微乳加纯化水稀释 100 倍后溶液呈澄清或微泛蓝色，并且在 24 h 内不会发生分层现象。结果见图 2 。

2.6 CCD-RSM 优化 DHA-SMEDDS 的处方

2.6.1 CCD-RSM 确定最优处方选择自变量时应考虑该因素是否对 SMEDDS 的形成有显著性影响，因此，选定油相质量分数（ X ₁ ）、乳化剂与混合助乳化剂的质量比（ K _m ， X ₂ ）为自变量。选择评价 SMEDDS 体系的平均粒径（ Y ₁ ）和 SMEDDS 处方载药量（ Y ₂ ）为处方评价的因变量。按处方比例精密称取油相、乳化剂、混合助乳化剂， 40 ℃磁力搅拌 30 min 后加入过量 DHA ，混匀， 10 000 r/min 离心 10 min ，取上清液即得 DHA-SMEDDS 。取适量 DHA-SMEDDS ，加纯化水稀释适当的倍数，摇匀，移取适量上清液，采用马尔文激光粒度仪测定平均粒径。精密称取上述 DHA-SMEDDS 1 g 置于 10 mL 量瓶中，加纯化水稀释至刻度， 10000 r/min 离心 15 min ，用 0.22 μm 的滤膜滤过，吸取续滤液 5 mL 至 10 mL 量瓶中，加甲醇适量超声 30 min ，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，按“ 2.2.1 ”项下方法测定 SMEDDS 中 DHA 含量，计算载药量。

实验采用 2 因素 5 水平的星点设计法（ CCD ）安排试验，结合伪三元相图，确定油相质量分数（ X ₁ ）、 K _m （ X ₂ ）的范围分别为 10% ～ 25% 、 0.67 ～ 1.5 。使用 DesignExpert 10.0 软件对各成分进行多元线性回归和 2 项式的拟合，根据拟合方程绘制三维效应面，表示各指标与各成分之间的关系。使用 Design Expert 10.0 软件，以平均粒径（ Y ₁ ）、载药量（ Y ₂ ）为因变量， X ₁ 和 X ₂ 为自变量，经过对上述因素进行多元线性回归和 2 项式方程拟合后，得到拟合方程 Y ₁ ＝ 32.04 ＋ 19.28 X ₁ － 8.02 X ₂ － 10.04 X ₁ X ₂ ＋ 9.12 X ₁ ² ＋ 0.18 X ₂ ² ， R ² ＝ 0.971 1 ， P ＜ 0.000 1 ； Y ₂ ＝ 13.9 ＋ 0.31 X ₁ ＋ 0.59 X ₂ ＋ 0.12 X ₁ X ₂ ＋ 0.7 X ₁ ² ＋ 1.01 X ₂ ² ， R ² ＝ 0.804 5 ， P ＝ 0.02 ；由上述方程可知， P 均小于 0.05 ，具有显著性差异，平均粒径和载药量均符合多元线性方程，拟合度良好，相关系数较高，结果具有统计学意义。实验结果见表 4 。

根据上述回归模型，绘制 3D 效应面图。结果见图 3 。其中任一变量保持中央水平不变，其他 2 个变量在优化水平范围内变化时，油相质量分数、 K _m 之间对于平均粒径而言相互影响较小。平均粒径随油相比例的增加而逐渐增大。而平均粒径因 K _m 条件变化的变化趋势则受油相的影响。油相比例较小时，平均粒径随 K _m 条件的增加而持续增大；油相比例较大时，平均粒径随 K _m 条件的增加而持续减小。油相、 K _m 之间的相互影响对于载药量而言较大。载药量随油相比例、 K _m 的增加而先减后增。

根据自微乳制剂的特点，比表面积和药物溶出与吸收的速度随粒径的减小而增大；载药量越高，实际口服剂量越小 ^[20] 。因此，综合考虑乳化剂毒性、无水乙醇含量对临床应用的影响，以粒径≤ 30 nm 为限制条件，油相在 15% ～ 25% 、 K _m 在 0.9 ～ 1.2 ，根据 Design Expert 10.0 软件的预测，综合考虑载药量和平均粒径 2 个指标对 SMEDDS 质量的影响，得到理论最佳处方为油相 15% ， K _m ＝ 1.2 ，即 MCT 15% 、 RH40 46.4% 、 PEG400 14.48% 、无水乙醇 24.12% 。

2.6.2 最优处方验证按照最优处方制备 3 批 DHA-SMEDDS 制剂，取一定量的 DHA-SMEDDS 制剂用水稀释适宜倍数后，分别测定其粒径与载药量，观察实测的载药量和平均粒径与预测的载药量和平均粒径之间的偏差 [ 偏差＝ ( 预测值－实测值 )/ 预测值] 。预测值与实测值偏差结果表明，实际的最优处方的平均粒径和载药量与软件预测结果之间偏差的绝对值较小。结果见表 5 。

2.6.3 处方药物加入量的确定根据“ 2.6.1 ”项下最优自微乳处方配制自微乳基质，分别制成含药量为 10 、 12 、 15 mg/g 的 DHA-SMEDDS ，加 37 ℃纯化水稀释 10 倍，观察是否有药物析出。当 DHA 的加入量大于 10 mg/g 时，加水乳化后的溶液放置时间在 8 h 内有药物析出，其原因可能是载药量超过了自微乳体系可形成稳定的界面膜时的最大承载量，自微乳经乳化后，药物可能没有全部包封在自微乳滴中，有少量药物溶解在乳化剂组成的胶团中，药物超过了乳化剂的溶解能力 ^[20] ， DHA 结晶析出。因此，将处方中 DHA 加入量调整为 10 mg/g 。

2.6.4 DHA-SMEDDS 的制备精密称取 MCT 3 g ， RH40 9.28 g ，无水乙醇 4.82 g ， PEG400 2.90 g 于茄形瓶中， 40 ℃下 300 r/min 磁力搅拌 30 min ，得空白自微乳。于空白自微乳中精密加入 200 mg DHA ， 40 ℃磁力搅拌 1 h ，得到 DHA-SMEDDS 。

2.7 DHA-SMEDDS 的质量评价

2.7.1 外观观察 DHA-SMEDDS 在 25 ℃存放时为透明油状液体，流动性较好。加纯化水稀释 100 倍后形成的微乳液为淡蓝色澄清透明溶液，具有很好的流动性。

2.7.2 微观形态观察取 DHA-SMEDDS 适量，加纯化水稀释适当的倍数，取少量微乳液滴到测试用有支持膜的铜网上，静置 5 min 后，用滤纸吸去多余液体，滴加 2% 磷钨酸溶液，负染 2 min ，烘干，于 TEM 下观察并记录图像。 DHA-SMEDDS 经稀释处理后的乳滴在 TEM 下为大小基本相同且分散均匀无粘连的圆球形。 TEM 结果见图 4 。

2.7.3 粒径分布与 Zeta 电位考察取 DHA- SMEDDS 适量，加 37 ℃纯化水稀释 100 倍，制得澄清透明的 DHA 微乳液。取微乳液适量，采用马尔文激光粒度分布仪测定 DHA-SMEDDS 的平均粒径、多分散性指数（ PDI ）和 Zeta 电位。测定结果表明， DHA-SMEDDS 平均粒径为（ 24.55 ± 0.18 ） nm （ n ＝ 3 ）， PDI 为 0.092 ± 0.028 （ n ＝ 3 ）， Zeta 电位为（ − 3.16 ± 0.14 ） mV （ n ＝ 3 ）。结果见图 5 。

2.7.4 载药量和包封率精密取 DHA-SMEDDS 0.5 g （ W ₀ ）于 10 mL 量瓶中，加甲醇适量，超声 30 min ，冷却至室温后加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，按“ 2.2.1 ”项下方法测定 DHA-SMEDDS 中 DHA 质量（ W ₁ ）。精密取 DHA-SMEDDS 1 g 于 10 mL 量瓶中，加 37 ℃纯化水稀释至刻度，摇匀，制成微乳液，转移至离心管中， 10 000r/min 离心 15 min ，滤过，精密量取续滤液 5 mL 至 10 mL 量瓶中，加甲醇适量超声 30 min ，冷却至室温后加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，按“ 2.2.1 ”项下方法测定 DHA 质量（ W ₂ ），根据公式计算载药量和包封率。

载药量＝ W ₁ / W ₀

包封率＝ W ₂ / W ₁

经计算， DHA-SMEDDS 载药量为（ 9.64 ± 0.01 ） mg/g （ n ＝ 3 ），包封率为（ 99.67 ± 0.10 ） % （ n ＝ 3 ）。结果显示， DHA 的载药量和包封率均较好。

2.7.5 乳化时间考察精密称取 DHA-SMEDDS 0.5 g ，滴入于 300 r/min 磁力搅拌下的 50 mL 37 ℃纯化水中进行乳化，测定形成淡蓝色澄清透明溶液所用时间。实验结果表明， DHA-SMEDDS 完全乳化成澄清透明的淡蓝色微乳液所需时间为（ 13.90 ± 0.10 ） s ，自乳化时间小于 2 min ，乳化效率高。

2.8 DHA-SMEDDS 稳定性初步研究

2.8.1 高速离心实验取 DHA-SMEDDS 适量，用 37 ℃纯化水稀释 100 倍，乳化后形成 DHA 微乳液，取该微乳液 5 mL ， 10 000 r/min 高速离心 15 min ，观察微乳液是否分层。结果表明， DHA-SMEDDS 的微乳液经高速离心后依然澄清透明，没有产生油水分离及药物析出现象。

2.8.2 强光照实验分别取 DHA-SMEDDS 0.5 g ，置于常温（ 25 ℃）、强光照（ 4500 ± 500 ） lx 条件下保存，于第 0 、 5 、 10 天观察外观，测定平均粒径及 DHA 的药物质量分数。结果如表 6 所示，放置 10 d 后， DHA-SMEDDS 及其乳化后的溶液仍澄清透明，微乳液粒径无明显变化，但药物含量下降了 15.35% 。因此 DHA-SMEDDS 应避光保存。

双氢青蒿素自微乳给药系统的制备及其评价

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