山东大学闫震课题组ES&T：阐明了产甲烷古菌对于砷的分子转化机制

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近日，山东大学闫震教授团队在 Environmental Science & Technology 上发表了题为 “Molecular Basis of Thioredoxin-Dependent Arsenic Transformation in Methanogenic Archaea” 的研究论文。已知产甲烷古菌在砷（ As ）生物地球化学循环中起着至关重要的作用，然而，人们对产甲烷生古菌介导的 As 转化的分子机制仍然知之甚少。本文报道了产甲烷古菌对砷的氧化还原和甲基化特性。研究表明，在产甲烷生长的指数期，通过细胞质 As 还原酶（ ArsC ）介导 As (V) 的还原，在固定阶段通过细胞质 As (III) 甲基转移酶（ ArsM ）介导 As (III) 的甲基化 ； ArsC 催化的 As (V) 还原和 ArsM 催化的 As (III) 甲基化表明， MA4683 编码的硫氧还蛋白（ Trx ）优先用作 ArsC 和 ArsM 的生理电子供体，提供了甲烷生成和 As 转化之间的氧化还原联系； ArsC 和 ArsM 与 Trx 的结构采用 AlphaFold-Multimer 建模，对复合物相互作用位点的关键半胱氨酸残基进行了定点突变，结果表明，与细菌 ArsC 或真核 ArsM 相比，古菌 ArsC 和 ArsM 使用了进化上不同的二硫键与 Trx 相互作用。本研究为 As 在产甲烷古菌中转化的生理作用和潜在机制的理解提供了重大进展 。

砷的生物地球化学循环与环境安全和人类健康密切相关，不同砷物种之间存在毒性和流动性的差异。砷的循环机制主要包括砷氧化、还原、甲基化和去甲基化等，各种微生物在 As 的生物地球化学循环中发挥作用已被证明，然而，微生物介导的砷转化的分子机制仍未阐明，特别是关于产甲烷古菌，这是一组在缺氧环境中广泛存在的专性产甲烷的微生物 。

As 的还原过程中，谷胱甘肽（ GSH ）和硫氧还蛋白（ Trx ）系统分别是革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌 ArsC 的电子供体。含有硫醇的化合物 GSH 和 Trx 已被证明在细菌 ArsM 催化的 As （ III ）甲基化中发挥作用。由于产甲烷古菌中缺乏 GSH ，一种含硫醇辅酶 M （ HSCoM ）是甲烷生成的必要辅助因子，被鉴定为比 GSH 更有效的电子供体。此外产甲烷古菌中存在 Trx 这一广泛的氧化还原系统，它作为产甲烷古菌中 ArsM 的还原当量的作用仍有待评估。

本研究旨在促进对产甲烷菌介导的砷循环转化的理解，并进一步了解产甲烷古菌中酶催化转化砷的分子机制。选择模型产甲烷古菌 Methanosarcina acetivorans 作为本课题的研究对象，探究微生物介导的砷的生物地球化学循环。

图文导读

M. acetivorans 介导 As(V) 还原和 As(III) 甲基化

图 1 不同浓度 As (V) 下 M. acetivorans 的生长参数和胞外 As （ III ）分析

(A) 生长曲线。 (B) 生长过程中甲烷的产生。通过 HPLC − ICP − MS 测量的 M. acetivorans 在含有 10 (C) 或 150 (D) μM As(V) 培养下的胞外 As(III) 丰度。

在指数阶段，添加低浓度（ 10 μM ）的 As(V) 刺激甲烷产生和 M. acetivorans 的生长；然而，添加高浓度（ 100 − 250μM ） As (V) 导致了剂量依赖的抑制作用，表明 As (V) 对 M. acetivorans 生长的毒性作用。在添加 10 或 150 μM As (V) 的培养基中，观察到细胞外 As （ III ）的浓度增加；然而，在产甲烷生长的固定阶段（ 5 − 10 天），细胞外 As （ III ）的浓度保持不变。从第 3 天到第 10 天，添加 10 或 150 μM As (V) 的无菌培养基表现出稳定的 As(III) 浓度，表明在高盐培养基中还原剂可能会还原 As(V) 。然而，在第 5 天 10 和 150μM As (V) 产甲烷生长过程中，化学还原仅为 As (V) 的 23.24 和 28.8% ，这些结果表明，在产甲烷生长的指数阶段， M. acetivorans 表现出还原 As (V) 的能力。

图 2 M. acetivorans 产甲烷生长过程中 As (V) 减少分析

(A) 通过检索 M. acetivorans 基因组推测的 As (V) 还原途径。 (B) 利用 CRISPR/Cas9 技术构建Δ arsC 菌株。利用 Cas9 的高效切割功能和包含 NotI 切割位点的特异性同源修复片段，完成了 arsC 中 43-bp 序列的缺失。Δ arsC 菌株的详细失活步骤和构建验证如图 S2 所示。 (C) 10 μM As (V) 生长的 M. acetivorans 的 WT 和Δ arsC 菌株的细胞外 As （ III ）丰度。 (D) 150 μM As (V) 生长的 M. acetivorans 的 WT 和Δ arsC 菌株的细胞外 As （ III ）丰度。

分析 M. acetivorans 基因组， MA3103 编码 ArsC （以下简称 Ma ArsC ），与革兰氏阳性菌的 ArsC 有 ~ 45% 的相似性。此外，还获得了编码 As （ III ）外排泵的推测基因 MA4353 ，负责从细胞中排出 As(III) ，然而，并未发现在能量保护过程中使用 As (V) 作为最终的电子受体与呼吸 As (V) 还原酶具有同源性的相关基因。通过使用 CRISPR/Cas9 技术灭活染色体 MA3103 位点，评估了假定的 Ma ArsC 在 As (V) 还原中的催化作用，在 10 和 150 μM As (V) 存在下， MA3103 位点的失活导致细胞外 As(III) 分别减少了 84.1% 和 69.1% 。这些结果表明， Ma ArsC 介导了产甲烷生长过程中 As (V) 的减少。

M. acetivorans 已被证明通过 MA3783 编码的 ArsM （以下简称 Ma ArsM ）在生长固定期介导 As(III) 到一甲基砷（ MMA ）的甲基化。本研究获得的结果与上述观察结果非常相似，添加 10 μM As (V) 或 As(III) 在产甲烷生长的第 20 天，生成 5% - 10% MMA 。然而，在产甲烷生长过程中没有检测到甲基化的化合物。

Ma ArsC 和 Ma ArsM 催化的 As (V) 还原和 As(III) 甲基化的表征

Ma ArsC 能够使用三种电子供体来还原 As (V) 。当 Trx7 作为电子供体（ 0.241 U/mg ）时， Ma ArsC 的活性显著高于 GSH （ 0.0216 U/mg ）和 HSCoM （ 0.0239U/mg ）。此外， Ma ArsC 对 Trx7 具有更高的亲和力， K m 为 4.83 μM ，而对 GSH 和 HSCoM 的亲和力更低， K m 分别为 54.3 和 37.0 μM 。 Ma ArsM 也能够利用三种电子供体催化 As(III) 甲基化为 MMA 和二甲基砷（ DMA ）。 Trx7 作为电子供体（ 0.107 U/mg ）时， Ma ArsM 的活性显著高于 GSH （ 0.0348 U/mg ）和 HSCoM （ 0.0394 U/mg ）。 Ma ArsM 对 Trx7 （ K m 为 448 45.1 μM ）的亲和力高于对 GSH 和 HSCoM ， K m 分别为 8547 和 6873 μM 。这些结果表明，与 GSH 和 HSCoM 相比， Trx7 是 Ma ArsC 和 Ma ArsM 催化 As 转化的首选电子供体 。

Trx7 与 Ma ArsC 和 Ma ArsM 的氧化还原相互作用

图 3 Trx7 与 Ma ArsC 和 Ma ArsM 的氧化还原依赖相互作用

(A) 用 Alphafold-Multimer 对 Ma ArsC 与 Trx7 的的配合物中进行建模。 (B) 用 Alphafold-Multimer 对 Ma ArsM 与 Trx7 的的配合物中进行建模。 Trx7 的两个活性位点半胱氨酸显示为青色，而 Ma ArsC 或 Ma ArsM 的相邻半胱氨酸显示为银色。 (C) 测量 WT 和 ArsC 突变体的 As (V) 还原活性。 (D) 测定 WT 和 ArsM 突变体的 As(III) 甲基化活性。

使用 AlphaFold-Multimer 对 Trx7 和 Ma ArsC 或 Ma ArsM 的复合物的结构进行了建模。 Trx7- Ma ArsC 和 Trx7- Ma ArsM 生成的模型分别获得了高置信度和中置信度（模型置信度，分别为 ≥0.8 和 ≥0.49 ） 。

复合物 Trx7- Ma ArsC 生成的模型显示， Trx7 的两个活性位点半胱氨酸残基（ Cys12 和 Cys15 ）与 Ma ArsC 的三个空间相邻的半胱氨酸残基（ Cys89 、 Cys96 和 Cys99 ）紧密对接。 ArsC 催化 As (V) 还原过程中，有可能产生一个或多个分子内二硫键；这些分子内二硫键是与 Trx7 的潜在相互作用位点，从而使 ArsC 的还原状态再生。通过丝氨酸取代确定 Ma ArsC 三个空间相邻的半胱氨酸残基 Cys89 、 Cys96 和 Cys99 的作用，分别生成突变体 C89S 、 C96S 和 C99S 。这些突变体使用 Trx7 作为电子供体，突变 C96S 不再拥有催化还原 As(V) 的能力，而突变体 C89S 和 C99S 保留 15.26 和 35.39 % 的 As (V) 还原能力。这些结果表明， MaArsC 的 Cys96 通过与 Cys89 或 Cys99 形成二硫键，从而与 Trx7 建立的相互作用。

复合物 Trx7- Ma ArsM 生成的模型显示， Trx7 的两个活性位点半胱氨酸残基（ Cys12 和 484 Cys15 ）与 Ma ArsM 的两个空间上相邻的半胱氨酸残基（ Cys24 和 Cys25 ）紧密对接。残基 Cys24 或 Cys25 可能与两个空间相邻的半胱氨酸残基（ Cys62 和 488 Cys150 ）形成二硫键；这些分子内二硫键是与 Trx7 相互作用的位点，从而使 ArsM 进行连续甲基化。将 Ma ArsM 的 4 个空间相邻半胱氨酸残基 Cys24 、 Cys25 、 492 Cys62 和 Cys150 突变为丝氨酸，分别产生 C24S 、 C25S 、 C62S 和 C150S 。利用 Trx7 作为电子供体对这些突变体的活性进行评估，发现 C25S 、 C62S 和 C150S 表现出甲基化活性完全丧失，而突变体 C24S 的活性与野生型酶相当。这些结果表明， Ma ArsM 的残基 Cys25 ， Cys62 和 Cys150 通过二硫键的形成与 Trx7 建立相互作用。

甲烷生成与砷转化相耦合

图 4 As (V) 还原和 As(III) 甲基化与甲烷生成途径的结合

MP ：甲氧苯嗪； HdrDE ：膜结合异二硫还原酶； Fpo ：膜结合 F ₄₂₀ 脱氢酶； Rnf ：红杆菌固氮复合物； HSCoM ：辅酶 M ； HSCoB ：辅酶 F ₄₂₀ ；还原铁氧还蛋白； CH ₃ − SCoM ：甲基辅酶 M ； CHO − H ₄ SPT ：亚甲基四氢蒽脲； FNO ： F ₄₂₀ H ₂ ： NADP ⁺ 氧化还原酶； FNR ：铁氧还蛋白： NADP ⁺ 氧化还原酶； TrxR ：硫氧还蛋白还原酶； Trx7 ：硫氧还蛋白 7 ； ArsC ： As (V) 还原酶； ArsM ： As(III) 甲基转移酶。

还原铁氧还蛋白（ Fd _red ）和还原辅助因子 F ₄₂₀ （ F ₄₂₀ H ₂ ）是通过 M. acetivorans 的甲基营养或乙酰分解甲烷生成的还原当量。 MA3103 位点编码的 MA ArsC 蛋白通过产生 MA3103 突变株催化 As (V) 的还原。鉴于 Ma ArsC 与来自革兰氏阳性细菌的 ArsC 的高度同源性，以及后者酶依赖于硫醇 / 二硫醚氧化还原系统进行 As (V) 还原， Fd _red 或 F ₄₂₀ H ₂ 不太可能是 Ma ArsC 的直接电子供体。然而， Fd _red 和 F ₄₂₀ H ₂ 可以通过 M. acetivorans 中的某些途径为 NADP ⁺ 提供电子： Fd _red ： NADP ⁺ 氧化还原酶（ Fnr ）和 F ₄₂₀ H ₂ ： NADP ⁺ 氧化还原酶（ Fno ）两种途径。由此生成的 NADPH 可以随后通过 TrxR 将电子传递给特征硫醇 / 二硫氧化还原蛋白 Trx7 ，从而进行砷的还原和甲基化。在生理条件下， Trx7 已被确定为 Ma ArsC 和 Ma ArsM 的首选电子供体，提供了甲烷生成和 As 转化之间的联系。

MaArsC 和 MaArsM 分别催化 As (V) 还原和 As(III) 甲基化的催化机理

图 5 Ma ArsC 和 Ma ArsM 分别催化 As (V) 还原和 As(III) 甲基化的催化机理

(A) Trx7 与 Ma ArsC 的相互作用。① Cys96 攻击 Cys89 ，形成 Cys89-Cys96 二硫键，为 As (V) 还原提供电子。②二硫键 Cys89-Cys96 被 Trx7 还原，生成还原性的 Ma ArsC ，③或 Cys99 通过二硫级联攻击 Cys96 ，形成 Cys96-Cys99 二硫键。④二硫键 Cys96-Cys99 被 Trx7 还原，从而再次生成还原性的 Ma ArsC 。 (B) Trx7 与 Ma ArsM 的相互作用。① As(III) 首先被甲基化为 MMA ，并产生一个 Cys25-Cys62 二硫键。② Cys25-Cys62 二硫键被 Trx7 还原，然后进行第二轮甲基化。③ Cys150 攻击 Cys62 形成 Cys62-Cys150 二硫键， MMA 进一步甲基化形成 DMA 。④最后， Cys62-Cys150 二硫化物被 Trx7 还原，允许循环重新开始。

两个分子内二硫键的形成以级联方式配合构象变化完成催化过程的结论在之前已经报道，在 Sa ArsC 的活性位点 p 环，二硫键之间形成级 Cys82 和 Cys89 二硫键，并推测该二硫键与 Trx 相互作用，本研究得到的结果证实了这一推测。 Ma ArsC 与 Trx7 的分子对接分析显示， Trx7 与该酶的残基 Cys89 和 Cys96 紧密对接，分别对应于 Sa ArsC 的 Cys82 和 Cys89 。然而，存在额外的残留 Cys99 距离 ~10Å ，提高了 Cys89 和 Cys96 攻击 Cys99 的可能性，造成第二个二硫键级联从而引起构象三元结构变化。这些结果表明，与来自细菌的 ArsC 相比，来自产甲烷古菌的 ArsC 可以在 As (V) 还原过程中产生额外的二硫键级联，从而为 ArsC 的再生提供了一个替代的途径。

已有文献解析 Cyanidioschyzon merolae （以下简称 Cm ArsM ）的 ArsM 晶体结构。 Cm ArsM 与甲基供体 SAM 的结合位点已经被发现，但是与电子供体 Trx 的相互作用位点仍然未知。通过将 Ma ArsM 的预测结构与已知结构对比，并进行相关氨基酸的突变，从而提出了依赖于 Trx7 和二硫键生成的甲基化过程，即甲基化 MMA 生成可能伴随着 Cys25 和 Cys62 形成第一个二硫键从而引起三元结构的构象变化，这个二硫键可能被 Trx7 打开从而进行连续的甲基化。 MMA 随后甲基化为 DMA ，伴随着 Cys62 和 Cys150 之间第二个二硫键的形成，然后被 Trx7 攻击，导致还原 ArsM 的再生。

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文章以模式产甲烷古菌 Methanosarcina acetivorans 为研究对象，明确了 M. acetivorans 在产甲烷生长的对数期将 As (V) 还原为 As (III) ，在产甲烷生长的稳定期将 As (III) 甲基化。利用 Crispr/Cas9 基因编辑技术揭示了由 MA3103 与 MA3783 编码的 ArsC 与 ArsM 分别是 M.  acetivorans 对于 As(V) 还原与 As(III) 甲基化的关键酶。通过在大肠杆菌中异源表达 MA3103 与 MA3783 并利用重组蛋白 N 端的组氨酸标签进行蛋白纯化，通过体外酶活测试并进行酶促反应动力学分析，确定古菌中 Trx7 是 ArsC 与 ArsM 的最适电子供体。运用 Alphafold-Multimer 预测了 Trx7 与 ArsC 和 ArsM 的蛋白互作位点，对其进行定点突变，揭示了 Trx7 与 ArsC 和 ArsM 的互作机理，阐明了产甲烷古菌不同于细菌的砷转化机制。本研究拓展了砷在全球甲烷动力学背景下生物地球化学循环的理解，揭示了砷循环和甲烷循环之间的相互耦合关系，为调节全球甲烷通量，探究微生物介导的砷的生物地球化学提供理论支撑。

本研究得到了国家自然科学基金青年与面上项目、泰山学者青年专家项目、山东省优青项目与山东大学齐鲁青年学者项目的资助。