Plus深读 | CRISPR通过染色质重构激活Oct4或Sox2单基因可以诱导多能干细胞形成

文章两点及总结

1. 引入CRISPR激活系统，分析基因在iPSC重编程过程中的直接作用

2. 发现Sox2或者Oct4单一蛋白的激活，就可以诱导iPSC产生

3. 证明了利用CRISPR染色质重构，导致组蛋白乙酰化修饰（H3K27ac），能够精准的结合和激活单一基因表达

4. 证明Oct4的长期激活以及诱导的iPSC重编程需要promoter和enhancer两个水平上的激活

5. 采用细胞、嵌合小鼠等直接手段，证明了以上方式产生的是功能性的iPSC

研究内容

1：dCas9-SunTag-VP64激活细胞内源性Sox2和Oct4的表达

如Figure 1A，研究者首先分别构建了Sox2和Oct4的CRIPSR过表达系统。为了验证这一系统的有效性和效率，研究者利用OG2 MEF cells，这种细胞包含Oct4-EGFP荧光，即Oct4表达的报告系统。

处理：如Figure 1B，转染SunTag、和18个sgRNA组成的pool后，更换诱导重编程培养基，发现：

1）4天及以后相应基因表达上升（Fig.1D）

2）7天后形成克隆，15天后Oct4表达，及Nanog、Sox2和SSEA-1表达（Fig.1C,F）

3）加入Feeder cells后，克隆能够稳定传代，即ESCs类似细胞

Figure 1: MEFs中建立iPSC

2：Sox2单基因过表达，能够产生有正常功能的iPSC

研究者进一步分析18个sgRNA中，能够单独起作用的关键性基因。如图S2A展示，研究者逐一去除sgRNA，发现Oct4、Sox2和Glis三个基因的过表达对于克隆形成至关重要。因此接下来作者集中分析这三个基因对于iPSC形成过程中的重编程的作用，发现sgRNAs组合OSG（O-127，S-84和G-215）能够使Oct4、Sox2和Glis三个基因过表达（Fig.S2B-C），并具有类似的iPSC克隆形成能力（Fig. S2D-G）。

研究者进一步分析了pool中包含的所有三个Sox2 sgRNAs，即S-84/136/148，发现它们都能引起Sox2表达上调、以及克隆的形成（Fig.2B-D）；并且位于多个转录激活因子例如Oct4、Nanog、p300以及Sox2本身的结合区域；更有意思的是，此区域附近也有激活型的组蛋白标记H3K27ac的结合（Fig.2A）。这些sgRNAs也能够行使类似第一部分中所有18个sgRNA pool共转的功能，促进iPSC的形成（Fig.2E-G）。这些iPSC的细胞多能性、核型都正常，表现为传代到第17代（S-17），能够与囊胚融合形成嵌合体小鼠（Fig.2H-K）。

Figure S2

Figure 2

3：S-17 iPSC制造S-17 MEFs，仍旧具有重建能力

将S-17 iPSC种回囊胚，继续发育到E13.5时收取MEF，发现约一半的MEF细胞表达S-17 iPSC上带的BFP，说明是S-17 iPSC的子代，称为S-17 MEFs（Fig.3A）。S-17 MEFs依然能够诱导表达Sox2（Fig.3B,D），且Sox2的高表达进一步促进了Oct4、Nanog、Rex1等iPSC重建相关基因的表达（Fig.3E-G），证明S-17 MEFs也具有iPSC的活性和重建能力。

更有趣的是，在这个重建过程中，Sox2表达的上升依然伴随着H3K27ac水平的提高，提示着表观遗传修饰在重建过程中的重要作用。

Figure 3

4：Oct4的enhancer和promoter同时被激活，能够起始iPSC重建过程

图S2A中已经分析，Oct4的表达会被上游的enhancer和promoter共同调控，并且在这两个区域的sgRNAs都对iPSC多能性的获得起到决定性作用。这两个区域附近同样存在重要转录因子的结合位点，以及表观遗传修饰H3K27ac的结合（Fig.4A）。

接下来研究者着重分析了这两个区域的作用（Fig.4A-B）：

Enhancer区，sgRNAs：O-2135，2066，1965

Promoter区，sgRNA O-127

同时target Enhancer+Promoter：O-127-2066，O-127-1965，O-127-2135

结果发现，前8天O-127-2066与单独O-127对Oct4的转录激活作用没有明显区别，但之后O-127-2066的激活作用明显更高（Fig.4B-C）。并且只有同时激活两个区域的细胞才能形成克隆，单独激活promoter的转染Oct-127并没有克隆形成能力（Fig.4D-F）。这些克隆细胞表型、表达、以及染色体核型都与iPSC基本一致（Fig.4E-H）。动物实验同样证明，这些细胞注射到囊胚后，具备融合、并继续分化的能力，可以产生健康的嵌合体小鼠，即具备广泛的多能性（Fig.4I-K）。

将VP64更换成p300core的乙酰化激活系统，同样能够得到相似结果（Fig.S4）。

Figure 4

Figure S4

Reference：

本文来源：Liu P, Chen M, Liu Y, Qi LS, Ding S.CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency. Cell Stem Cell. 2018 Feb 1;22(2):252-261.e4.

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