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各位小伙伴们大家好，暑期来临，天气炎热的同时，希望大家学习的热情也能持续高涨！江江包依旧饱含热情，与小伙伴们一起学习独特且前沿的研究思路！今天江江包与大家一起来学习一篇聚焦
单细胞分析和多种机器学习
的文章，研究内容非常标准，适合医学方向的小伙伴学习复现！
单细胞RNA-seq是近些年备受关注的技术，可以对肿瘤内各种细胞群和表型状态进行更充分的鉴定，并且能提供对肿瘤异质性和进化的多角度理解。今天江江包来和大家一起学习一篇
上海交通大学医学院
的研究论文，文章
聚焦于应用单细胞RNA-seq分析和多种机器学习的预后模型在肿瘤免疫和预后中的作用
，快来跟江江包一起看看吧：
1、单细胞RNA-seq分析
：通过单细胞RNA-seq技术，对ccRCC及良性肾脏组织进行数据收集和分析，经过质量控制、基因筛选和降维处理，最终进行细胞聚类和注释，揭示了肿瘤细胞的异质性。
2、多种机器学习构建和测试预后模型
：利用101种机器学习算法，结合六个独立的ccRCC RNA数据集，构建并验证MECRGS预后模型，通过降维、批次效应校正和差异基因表达分析，系统探讨其临床和免疫学特征。
综合来看，该研究发现了一种独特的 ccRCC 肿瘤细胞亚型，确定了基因表达特征，并揭示了这些细胞与其他细胞类型之间的潜在串扰模式，以及免疫抑制性微环境的建立过程。~
ps：生物医学领域的研究需要广度也需要深度，不仅需要广泛学习研究思路，还要做出研究的差异性，扫码联系江江包，迅速积累研究思路和方法！
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题目
：
透明细胞肾细胞癌恶性上皮细胞相关基因的综合研究：预后特征的开发和肿瘤微环境相互作用的探索
杂志
：Journal of Translational Medicine
影响因子
：IF=6.1
发表时间
：2024年7月
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研究背景
肾细胞癌（RCC）是一种常见的肾脏恶性肿瘤，起源于肾上皮细胞。近年来，免疫检查点抑制剂作为各种癌症的治疗方法显示出广阔的潜力，然而只有一部分患者获得了显著且持久的优势，因此对新型生物标志物或特征的需求越来越大。单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步迅速增强了肿瘤内各种细胞群和表型状态的鉴定，并提供了对肿瘤异质性和进化的全面理解。本研究通过分析scRNA-seq数据和大量RNA测序数据，基于101种机器学习算法开发了恶性上皮细胞相关基因特征（MECRGS），系统探讨了MECRGS在预测ccRCC患者预后、免疫治疗反应及其与免疫和临床特征的关系方面的表现。
研究思路
研究收集了ccRCC和良性肾脏组织的单细胞RNA-seq数据，经过质量控制和降维处理后进行细胞聚类和注释。然后利用101种机器学习算法构建和验证预后模型MECRGS，通过六个独立的ccRCC RNA数据集进行预处理、批次效应校正和差异基因表达分析，系统探讨其临床和免疫学特征，揭示了肿瘤细胞的异质性及其在免疫抑制微环境中的作用。
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主要结果
1.使用scRNA-seq数据鉴定恶性上皮细胞相关基因
为了探索ccRCC恶性上皮细胞与正常肾脏相比高表达的基因，
对GSE159115获得的8个RCC肿瘤和6个良性人肾组织进行了scRNA-seq分析
。在质量控制之后，利用harmony去除了批次效应。随后进行了
t-SNE降维，将 25 个亚群分配给 11 种不同的细胞类型
（图1A）。热图展示了每个细胞群的顶级标记基因。不同细胞类型的百分比在肿瘤和正常组织之间差异很大，
上皮细胞占总细胞群的很大比例
（图1B,C）。利用InferCNV，将恶性细胞与正常细胞区分开来，将
所有来源于肿瘤的上皮细胞归类为恶性细胞
，其表现出高水平的拷贝数变异（图1D）。在进行鉴别分析以比较ccRCC中的恶性和非恶性上皮细胞后，利用TCGA KIRC批量RNA-seq数据进行验证，
将219个基因指定为恶性上皮细胞相关基因（MECRG）
（图1E,F）。GO分析表明，这些MECRGs在与氧水平降低、缺氧反应和免疫系统过程负调节相关的通路中显着富集（图1G）。此外，KEGG通路分析显示，与HlF-1信号通路、抗原加工和呈递以及糖酵解/糖异生相关的通路显著富集（图1 H）。
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图1
鉴定癌细胞和正常上皮细胞之间的DEGs
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2.MECRGS的集成开发和评估
对219个MERG进行了单变量Cox分析，并确定了71个预后相关基因进行了基于机器学习的整合方法，以确定具有最高准确性和稳定性的最优模型。
在101个机器学习模型中，排名前 5 位的模型表现出较高的平均一致性指数（C-index）值
（图2A）。
最终选择了“CoxBoost + Ridge”作为最终选择
，因为它具有卓越的性能和简单性。最后，我们基于CoxBoost和Ridge组合模型开发了一种恶性上皮细胞相关特征（MECRGS），该特征在多个数据集中表现出很高的准确性。
根据survminer包计算出的最优临界分数，
将ccRCC患者分为MECRGS高分组和低MECRGS分组
（图2B）。PCA算法结果表明，使用MECRGS模型基因可以对TCGA-KIRC队列中的患者进行准确分类，在所有数据集中，
MECRGS 评分高的患者总生存期明显缩短
（图 2C-I）。随后，我们进行了时间依赖性ROC分析，以评估MECRGS在生存方面的鉴别能力（图2J）。此外，与高MECRGS组相比，
低MECRGS组患者的无进展间期（PFI）和疾病特异性生存期（DSS）明显更长
（图3A,C）。AUC 值支持 MECRGS 模型在预测生存结果方面的准确性（图 3B,D）。总体而言，这些结果进一步凸显了MECRGS在多个独立队列中的卓越表现。
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图2 开发和验证基于机器学习的预后特征 MECRGS
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3.MECRGS与临床特征的关系
研究旨在
评估MECRGS与各种临床性状之间的相关性
。多因素Cox分析表明，在调整临床因素后，
MECRGS是训练队列中OS、DSS和PFI的独立预后因素
（图3E,F）。这一发现在其他数据集中也得到了验证，表明MECRGS作为ccRCC预后标志物的稳健性（图3G）。为了进一步评估MECRGS与其他临床病理特征相比的优越性，在训练和验证队列中进行了全面比较。结果表明，
MECRGS和临床阶段的预测能力比每个个体特征都要好
（图3H-J）。此外，将MECRGS与临床分期相结合时，综合模型显示出
比单独使用MECRGS或临床分期更高的C指数
（图3K-M）。因此，MECRGS与临床阶段的结合可能会进一步提高预测模型的性能。
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图3 MECRGS的生存分析和预测性能评估
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4.
MECRGS 对 ccRCC 发炎但免疫抑制的 TME的影响
采用IOBR R软件包
全面分析TCGA-KIRC队列中高MECRGS亚组和低MECRGS亚组中免疫细胞的浸润情况
。结果显示，
免疫细胞浸润水平在高MECRGS患者中显着升高，表明免疫激活状态（图4A,B）。还发现在高MECRGS组中，通过ESTIMATE包获得的免疫评分更高。相比之下，低MECRGS组显示出内皮细胞、平滑肌细胞和其他基质细胞的高富集。尽管如此，在高MECRGS组和低MECRGS组之间观察到的基质评分没有显着差异
（图4C）。此外，高MECRGS组不仅显示出与趋化因子受体（CCR）、T细胞共刺激和炎症促进相关的免疫细胞和免疫特征水平升高（图4D），也表现出调节性T细胞（Tregs）、癌症相关细胞外基质（C-ECM）和肿瘤浸润性调节性T细胞（TITR）特征的显着激活（图4E）。这
表示免疫状态疲惫和抑制
。然后比较了免疫调节因子的表达谱，发现高MECRGS组富含耗尽的CD8 + T细胞标志物（图4F）。它们还起到了免疫检查点的作用。这一发现表明，与低MECRGS组相比，
高MECRGS组表现出免疫检查点分子的表达升高
，可能是为了逃避免疫激活后的免疫破坏。
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图4 两个亚组之间免疫浸润和免疫调节的改变
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5.
在单细胞水平上研究MECRGS的中心基因
为了
在单细胞转录组水平上探索MECRGS在肿瘤微环境（TME）中的功能
，我们对不同细胞类型中枢纽基因的表达谱进行了分析。使用 FindClusters 函数对肿瘤细胞进行聚类，
鉴定了一种肿瘤亚型 PLOD2 + SAA1 + ccRCC 细胞
，其显示出更高的 MECRGS 评分、CNV 评分和干性评分（图 5A-D）。此外，我们在另外四个scRNA测序数据集中观察到了这种特定肿瘤细胞簇的存在和Renji TMA队列（图5E），其特征是 PLOD2、SAA1、C1R 和 C1S 的表达水平升高。重要的是，
这些基因的表达随着 ccRCC 患者 TNM 分期的进展而增加
，表明它们可以作为 ccRCC 的有价值的预后指标（图 6F-M）。这些发现表明
基因的上调可能与ccRCC的进展和侵袭性有关
。此外，对Hallmark通路的GSVE分析表明，这种肿瘤细胞亚型在与上皮-间充质转化、糖酵解、活性氧通路、干扰素α反应和补体相关的通路中表现出更高的活性（图6N）。
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图5 ccRCC中肿瘤上皮细胞的瘤间异质性
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6.
PLOD2 + SAA1 + 肿瘤细胞的通讯与免疫治疗
研究了 PLOD2 + SAA1 + 肿瘤细胞与 TME 中其他类型细胞的相互作用
。根据我们的研究结果，我们
观察到 PLOD2 + SAA1 + 肿瘤细胞能够与 TME 细胞进行通信
，并在 SPP1、MIF、PTN 和 MK 等信号通路中充当强大的发送者和影响者（图 6A-F 和 7A）。LIGHT 信号通路涉及淋巴毒素相关诱导配体的TNF家族成员与其受体之间的相互作用。该通路
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