Plus深读 | 胚胎干细胞和胚胎早期发育中的表观修饰

本综述“The interplay of epigenetic marks during stem cell differentiation and development”就是分析了在干细胞分化和胚胎早期发育过程中，表观遗传学修饰的动态变化、以及对下游转录事件和细胞分化的影响。

本文的作者Hendrik G. Stunnenberg领导研究团队长期从事表观遗传修饰相关研究，十数年来研究领域涵盖了组蛋白甲基化以及其催化酶和去甲基化酶，DNA甲基化以及其催化酶和羟化酶等等，发展了作为研究基础的多种研究手段，提出了领域内多个基本理论，堪称领域内权威之一；本篇综述中也大量引用了Stunnenberg教授领导团队及其相关衍生人物的研究结果。

BOX1：小鼠早期胚胎发育时期，以及对应多能干细胞分期

真核生物的DNA缠绕在组蛋白八聚体外，构成核小体；核小体进一步组织，这种大型的DNA-组蛋白符合结构，就是染色质/染色体。在发育过程中，表观遗传信息（即不是由DNA序列保存和编码的遗传信息）就保存在染色质的化学修饰、结构变化、以及三维折叠中。这些表观遗传信息也会调控转录，比如会形成基因印记（Genomic imprints），可以标记染色体的双亲来源。表观基因组调节变化控制着细胞可塑性、并将细胞对环境变化和发育做出的适应遗传下去。表观遗传信息的不同层面、不同调控之间是紧密联系的。表观遗传学调控的异常会影响一系列生命过程，产生疾病；例如许多发育异常疾病、肿瘤等，都能检测到其中表观遗传修饰出现问题。表观遗传修饰可以存在于DNA水平上（例如甲基化）、和组蛋白上（例如甲基化、乙酰化、泛素化等）。 ^{（ 1-2 ）}

发育过程中存在许多表观遗传水平上的波动。首次波动出现在受精作用之后，来自父本和母本基因组的不同表观遗传印记，大规模的重排，从而形成合子子代自身的表观基因组，引起zygotic gene activation (ZGA)。第二次波动发生在囊胚形成过程中，DNA甲基化在变化中被清除，组蛋白修饰重新洗牌，雌性细胞中的两条X染色体都被激活，转录活动相应激活。胚胎着床后，第三次表观遗传重组发生，一批转录抑制型的表观修饰（比如H3K27me3、DNA甲基化等）形成，染色体结构重新收缩，雌性细胞中的一条X染色体失活。另外还有一部分细胞的表观基因组会在此时期再次重组，维持干性状态，成为primordial germ cells (PGCs)。

1. ESCs细胞中的表观基因组

干细胞的维持与分化与多种因素相关，其中表观遗传修饰既能够影响染色质结构、松紧程度，也能直接影响关键基因的转录。作者收集和分析早期胚胎不同发育阶段、胚胎干细胞分化不同程度中的表观遗传修饰水平，发现主要集中在组蛋白和DNA甲基化等水平：

1.1 组蛋白修饰： 组蛋白修饰后，对基因表达激活或者沉默存在不同功能：

1）激活型的组蛋白修饰：

a. H3K4甲基化：

a) H3K4me3： 真核生物中，H3K4me3位于启动子区域、以及一小部分位于远端调控序列附近。H3K4me3由组蛋白甲基转移酶等蛋白复合体控制：酵母SET1（COMPASS）复合物；哺乳动物的COMPASS类似物，包括SETD1A、MLL1、MLL2等。这些复合体蛋白缺失会造成原肠胚发育期间死亡，证明H3K4甲基化对生命体至关重要 ^{（ 1 ）} 。

卵细胞中的的H3K4me3广泛存在，到受精后只存在于转录起始位点（Fig.1），在ESC发育不同时期基因组的水平上相对稳定。传统认为H3K4me3促进基因表达，但又不能直接作为基因转录激活的标记，并且激活机制尚不明晰。

b) H3K4me1、H3K4me2： 一般存在于基因间区域和远端的调控元件上，起到无差别激活的作用。H3K4me1由包含MLL3和MLL4的蛋白复合体催化（Fig.1），缺失MLL3的小鼠胚胎发育正常，但围产期致死；而MLL4突变体在胚胎期致死，说明MLL4在胚胎发育时期是必要的。H3K4me1的去甲基化酶LSD1突变后使得甲基化水平异常升高，ESCs和HSCs会不断增值，但不能继续向正确的方向分化。综上所述，H3K4me1并不会显著影响细胞性状维持，而是主要在细胞形态和身份转化过程中起作用 ^{（ 1 ）} 。

Fig.1 早期胚胎发育及多能干细胞分化过程中，不同表观遗传修饰及其调节蛋白的动态表达

c. H3K27乙酰化：

H3K27乙酰化主要存在于激活性的调控元件附近，比如基因的启动子、增强子等等。H3K27的乙酰化是由组蛋白乙酰转移酶（HATs）催化的，如CREB结合蛋白和p300（CBP/p300）等。H3K27ac经常与H3K4me1、H3K27me3共同作用，比如在鼠源的ESCs中，约有一半含有H3K4me1的增强子区域同时也有H3K27ac的修饰；并且大多数的H3K27ac标记的增强子区域含有H3K4me1的标记。大约70%包含H3K27ac标记的增强子都处于激活状态，能够在体内促进基因的转录 ^{（ 1-3 ）} 。

组蛋白去乙酰化酶HDAC1主要影响早期胚胎中组蛋白去乙酰化作用，Hdac1突变体中，胚胎的囊胚发育被延迟、并在着床后致死。缺失HDAC1的体外培养的ESCs全能性持续存在，但增殖能力减弱。

BET（Bromo- and extra- terminal）蛋白是组蛋白乙酰化的识别者，通过识别乙酰化、介导相应的反应通路。BET蛋白的敲除、功能缺失以及抑制剂处理，都会导致胚胎致死，再次佐证了H3K27ac影响ESC细胞自我更新和胚胎发育 ^{（ 3 ）} 。

2）抑制型的组蛋白修饰：

a. H3K27me3

H3K27me3修饰主要位于启动子的CpG岛区域、以及基因间区域，与基因沉默相关（Fig.1）。并且，H3K27me3一般处于DNA甲基化水平比较低甚至未被甲基化的区域，比如HOX基因簇（homeobox）。H3K27me3也起到维持雌性细胞被失活的那条X染色体转录抑制状态的作用。PRC2（Polycomb repressive complex 2）能够催化H3K27me3的形成，在ESCs的早期分裂和着床前发育过程中并没有功能，只有在原肠胚开始分化后，PRC2的功能缺失会导致胚胎死亡。总结而言，H3K27me3对转录的抑制功能在原初的胚胎干细胞中不是必要的；然而在后续分化时期、特别是在着床后发育过程中至关重要。另外，H3K27me3更多的是作为一个基因沉默的标志，比如在缺失PRC2组分的小鼠ESCs中，转录抑制往往发生在发育过程进行到一定阶段后，也就是说H3K27me3的标记是作为基因沉默的维持者工作，而不是导致其沉默的起始原因 ^{（ 2-3 ）} 。

b. H3K9me2

H3K9me2与基因沉默相关，在染色体上的分布经常以超大尺度存在，甚至可能超过4Mb，一般分布在基因本体和基因间区域（Fig.1）。催化H3K9me2的蛋白复合体中主要包含G9A（EHMT2）和GLP（EHMT1），缺陷的小鼠胚胎都会在E9.5时致死，但ESCs能够被持续培养，证明H3K9me2在胚胎发育过程中起作用，但在ESCs分化过程中尚存争议 ^{（ 3-4 ）} 。

1.2 DNA修饰

a. DNA甲基化

DNA甲基化发生在CpG的两个核苷酸上，由DNA甲基转移酶家族的蛋白催化：DNMT1，DNMT3A，DNMT3B和DNMT3L。DNA甲基化会影响DNA构想的变化，削弱DNA与蛋白质之间的相互作用，比如转录因子结合、并激活DNA转录等，从而影响相应位置基因的转录。DNA甲基化能够调控胚胎发育、精子形成、个体发育等等几乎所有的发育过程 ^{（ 5 ）} 。

b. TET蛋白催化DNA去甲基化：

DNA甲基化是一个可逆的过程，能够被两种机制去除：细胞分裂时DNA复制导致丢失一半；也可能由去甲基化酶直接催化，即被甲基胞嘧啶双加氧酶TET家族蛋白（TET1/2/3）催化，形成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。5hmC通常在位于基因增强子部位。着床前胚胎中的DNA甲基化水平达到最低，在着床后的外胚层中迅速上升。在着床前的早期胚胎发育过程中以及PGC过程中，亲本DNA去甲基化并不依赖于TETs蛋白的功能，而是更多的是随着DNA复制、细胞分裂被动去除；着床后的胚胎发育过程中，DNA去甲基化过程需要TETs去甲基化酶活性 ^{（ 5-6 ）} 。

2 染色体三维结构

分裂间期的基因组按照染色体功能的拓扑结构（topologically associated domains，TADs）分布（Fig.2），这种结构的改变也会对于染色质功能、基因转录和抑制等起到作用。有趣的是TADs在不同细胞类型、分化水平甚至不同物种中间都是相对稳定的。TADs的边界处一般会结合CTCF（76%），可能在限制表观遗传标记的跨TADs功能上起作用。CTCT结合位点去除会导致激活型的染色体修饰错误的传递到周边预定沉默区域，证明TAD作为一个结构性框架能够影响表观遗传信息。多个TADs聚合后有道染色体两种结构形式（A和B）（Fig.2b）。其中A模式下的染色体处于激活状态，而B则是失活状态，且不同细胞分化状态和表观遗传标记下，A/B两种状态可以相互转换 ^{（ 7 ）} 。

总之，在不同的胚胎发育时期和细胞状态下，存在不同层面上的组蛋白修饰。抑制性的表观遗传学标记，包括DNA甲基化、H3K27me3、H3K9me2等的功能在维持多能性的干细胞中、以及着床前胚胎发育过程中不是必要的。这些抑制性标记在着床后的发育过程中会迅速增加，提示了在胚胎发育过程中的重要作用 ^{（ 2,5,8 ）} 。

Fig.2 基因组/染色质的三维结构

3. 表观遗传标记之间的相互作用

转录活性与组蛋白表观修饰之间，谁因谁果的关系，目前仍存在争辩。同样的，在细胞分化过程中不同表观遗传修饰之间是否存在协同、拮抗、以及冗余的关系，也尚未研究清楚。下面来讨论细胞分化和机体发育过程中，不同表观遗传标记以及其调控网络之间的关系 ^{（ 8 ）} 。

1）组蛋白修饰、转录因子之间的相互影响

a. H3K4me1和H3K27ac：

二者都是增强子上激活型的组蛋白修饰，能够促进基因转录；H3K4me1的修饰一般先于H3K27ac，即H3K4me1先修饰组蛋白、H3K27ac化，称为enhancer priming（Fig.3）。

b. 转录因子辅助组蛋白修饰：

考虑到大多数组蛋白修饰酶并没有专门的DNA序列识别位点，相应的组蛋白修饰酶可能是通过其他含有DNA识别和结合结构域的蛋白实现，比如转录因子。举例而言，PDX1（pancreas–duodenum homeobox protein 1）是一个转录因子，对H3K27ac修饰是必须的；另一个转录因子FOXD3则会促进增强子序列的组蛋白上H3K27ac和H3K4me2的形成，启动附近基因的转录活性（Fig.3）。

抑制NF‑κB的活性就会降低H3K4me2的水平，进而影响下游增强子的从头激活 ^{（ 8 ）} 。

c. 组蛋白修饰辅助转录因子功能：

H3K4me1会影响转录因子定位和启动，比如体细胞脱分化关键转录因子包括OCT4，KLF4，SOX2和MYC等 ^{（ 8 ）} 。

抑制型的表观遗传修饰，比如H3K9me2/3和DNA甲基化等，往往会抑制结合位点附近的重编程相关转录因子的结合和转录激活作用，只有将抑制型表观遗传修饰移除后才会启动重编程 ^{（ 5-8 ）} 。

总之，这些研究证明了转录因子对启动子的激活、以及组蛋白修饰（例如H3K4的甲基化、H3K27的乙酰化等等）对于基因转录事件的开始都起到一定作用，在某些情况下组蛋白修饰（H3K4me1）在先、诱发转录因子的激活，另外转录因子的结合和激活又能影响组蛋白修饰的产生。

Fig.3 增强子激活与失活

d. H3K27me3与H3K4me3的bivalency

ChIP测序发现，一些基因的启动子能够同时被激活性的组蛋白修饰H3K4me3和抑制性的组蛋白修饰H3K27me3同时修饰，称为“bivalency”，功能可能是保证基因转录不被突发因素干扰而紊乱，比如H3K4me3能够抑制DNA甲基化，防止该位点出的转录被永久性封闭；而H3K27me3则能够保证保证该处基因处于较低的表达水平。有趣的是，在2i培养的ESCs中，细胞只维持自我增殖而不会分化，相应的这种bivalency现象也不存在。MLL2是H3K4me3的主要催化酶，突变会导致生长延缓，原肠胚时期后即死亡；同样的，UTX（KDM6A）能够催化H3K27me3的去甲基化，突变会导致胚胎致死，但两个突变都不会影响ESC的增殖。总之，bivalency能够作用于ESCs分化过程中，特别是着床后的胚胎发育时期中；但对于多能干细胞的维持没有明显作用 ^{（ 7 ）} 。

2）DNA甲基化修饰与组蛋白修饰

DNA甲基化在ESC的不同发育时期与其他表观调控标记之间存在不同的作用：比如DNA甲基化能够抑制H3K27me3的形成，与H3K9me2具有协同作用，同时又能够促进激活性组蛋白修饰H3K27ac，促进转录 ^{（ 4-6 ）} 。

3）染色体结构和表观遗传修饰的关系

表观遗传修饰能够直接影响基因组的三维结构，从而影响增强子和启动子的功能、以及原件之间的相互作用，影响染色体在细胞核内的定位、转录因子的结合、结构蛋白的附着等，进而介导染色体之间的相互作用，最终影响基因的表达 ^{（ 7 ）} 。

Fig.4 不同分化时期的DNA甲基化和组蛋白修饰