大家好！今天来了解一种高效的蛋白质复合物纯化和表征策略的文章——《Biofunctionalized dissolvable hydrogel microbeads enable efficient characterization of native protein complexes》发表于《Nature Communications》。蛋白质复合物在生命过程中起着关键作用，然而其分析面临诸多挑战。传统方法在纯化和表征上存在局限，如低输入样本的处理以及PTMs带来的异质性问题。本文介绍的SNAP-MS方法，基于生物功能化的可溶性水凝胶微珠和天然MS技术，为解决这些问题提供了新途径。通过独特的工作流程和算法辅助，该方法在多个应用实例中展现出高效纯化和准确表征蛋白质复合物的优势。
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一、研究背景与目的
蛋白质复合物在生命过程中执行着关键的生物功能，对其进行分析对于理解分子水平的生物过程至关重要。然而，现有的方法在蛋白质复合物的纯化和表征方面面临着诸多挑战，如低输入样本的捕获和生化成分的解读，以及蛋白质翻译后修饰（PTMs）带来的高度异质性问题。本研究旨在开发一种高效的蛋白质复合物纯化和表征策略，即SNAP-MS（Stationary-phase-dissolvableNativeAffinityPurificationandMassSpectrometriccharacterization），以解决这些问题。
二、SNAP-MS方法介绍
（一）SNAP-MS工作流程
1.SNAPbeads的制备
化学合成与结构
：SNAPbeads是基于水凝胶的微球。对于化学可溶形式的SNAPbeads，合成了含有二硫键的可化学裂解的Linker1，并使用N,N
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-Bis(acryloyl)cystamine作为可裂解的Linker2。对于光可溶形式的SNAPbeads，合成了基于o-nitrophenyl的Linker2，并采用光敏感的PC-Alkyne-PEG4-NHS酯作为Linker1。
微珠形成过程
：通过微流体辅助乳液技术生成前驱体混合物液滴，随后用APS-TEMED引发聚合反应，形成特定大小的微珠。之后对诱饵蛋白和微珠进行修饰，使其通过点击化学进行偶联。
例如，将诱饵蛋白修饰为含有DBCO基团，微珠修饰为含有叠氮基团。
2.蛋白质捕获与释放
捕获过程
：将生物样品与SNAPbeads孵育，通过特异性的诱饵-靶标结合捕获蛋白质复合物。例如，在研究中使用了多种诱饵-靶标系统，如用结合了链霉亲和素（SA）的SNAPbeads捕获生物素修饰的绿色荧光蛋白（GFP），用结合了血红蛋白（Hb）诱饵的SNAPbeads从人血清中捕获触珠蛋白（Hp）等。
释放机制
：传统的竞争洗脱步骤被微珠基质溶解所取代。对于化学可溶的SNAPbeads，在还原条件下，连接子中的二硫键断裂，释放出诱饵-靶标复合物；对于光可溶的SNAPbeads，在紫外线照射下，光敏感的连接子不可逆地断裂，实现复合物的释放。这一过程避免了传统方法中因竞争洗脱或连接子切割效率低而导致的问题。
3.下游分析
释放的诱饵-靶标复合物可直接用于天然MS分析，或结合其他结构生物学技术如冷冻电镜（cryo-EM）进行进一步表征。例如，在对GFP和Hp-Hb复合物的研究中，都进行了天然MS分析。
（二）算法辅助分析
利用诱饵作为电荷去除剂和质量校正器，通过串联MS的“片段互补”方法提高分析异质糖基化复合物的准确性。根据不对称电荷分配效应，在串联MS过程中，诱饵亚基从诱饵-靶标复合物中解离，去除了多个电荷，增加了电荷分辨率，提高了质量/电荷测定的准确性。同时，诱饵的已知质量可用于校正目标质量测定的不准确之处，解决了因目标离子在不同电荷状态下质量分布不一致导致的传统算法失效的问题。
三、实验结果展示
（一）提高纯化效率
1.与传统珠子比较
在纯化绿色荧光蛋白（GFP）模型蛋白时，将SNAPbeads与传统的琼脂糖珠（结合了Strep-Tactin，ST）和磁珠（结合了SA）进行比较。结果显示，磁珠由于SA和生物素之间的高亲和力结合，在非变性条件下无法通过竞争洗脱释放目标GFP；琼脂糖珠虽能通过竞争洗脱实现一定程度的目标回收，但因大量背景蛋白的非特异性吸附导致特异性较低。而SNAPbeads表现出更高的回收率和特异性。
2.不同类型珠子比较
将SNAPbeads（Type1beads）与非溶解的对应物（如用相同前驱体配方但不可裂解的聚合物间交联剂制成的hydrogelbeads，Type2beads，以及修饰了可裂解连接子的磁珠，Type3beads）进行比较。结果表明，SNAPbeads在诱饵共轭效率、蛋白质捕获和连接子裂解等方面表现更优，能够更有效地纯化目标蛋白。
（二）与天然MS兼容
1.复合物分析
以纯化两种在大肠杆菌中过表达的增强型GFP变体（野生型EGFP和其单体型A206K突变体，mEGFP）为例，用结合了抗GFP抗体（Ab）的SNAPbeads进行纯化，溶解微珠并去除聚合物后，通过天然MS进行分析。完整质量（MS1）测量揭示了目标-诱饵（EGFP-Ab）复合物的结合计量关系，串联质量（MS2）测量通过碰撞解离去除诱饵，可区分两种GFP变体。
2.亚基释放与分析
在蛋白质复合物的碰撞解离过程中，根据诱饵和靶标的大小关系，可以选择性地释放诱饵或靶标亚基。例如，在EGFP-Ab复合物中，由于诱饵较大，目标EGFP作为高电荷密度的解离亚基被释放；而当使用较小的单域抗体（sdAb）作为诱饵时，sdAb作为高电荷密度亚基被释放，目标GFP处于较低电荷状态。
（三）应用实例
1.蛋白质结构完整性研究
以亲和素（包括天然蛋清亲和素，egavidin和重组玉米表达的亲和素，ravidin）为例，用结合了生物素的SNAPbeads进行纯化。在天然MS表征中，回收的亲和素复合物在低碰撞解离设置下保留了其天然的四聚体状态，未丢失任何亚基。进一步增加碰撞能量可释放亲和素单体，且回收的亲和素与原始亲和素在蛋白质形式分布上高度一致，证明了SNAP-MS方法能够有效保留蛋白质的四级结构和蛋白质形式分布。
2.血液样本分析
从人血清中纯化和表征触珠蛋白（Hp）-血红蛋白（Hb）复合物。不同供体的Hp在SDS-PAGE和天然MS中表现出不同的总丰度和寡聚体分布模式。通过Hb作为诱饵，结合天然MS分析，可以揭示Hb在Hp-Hb复合物中的占位情况，以及Hp的寡聚体状态和与Hb的结合计量关系。同时，利用诱饵Hb上连接子导致的质量位移，可在串联MS中区分诱饵Hb和血浆Hb。
