用于肺部给药的磷酸奥司他韦微粉的制备及肺组织分布初步考察
Preparation and Preliminary Investigation on Lung Distribution of
Oseltamivir Phosphate Powders for Pulmonary Administration
邹佳辉1，黄偲偲1，邱 娜1，汤 玥2，姜力群1*
(1. 徐州医科大学，江苏省新药研究与临床药学重点实验室，江苏徐州 221004；2. 中国药科大学药学院，江苏南京 210009)
摘要：
磷酸奥司他韦(1) 是一种神经氨酸酶抑制剂类抗流感病毒药物。采用喷雾干燥方法制备了可用于肺部吸入给药的1
微粉。通过正交设计得到的最优处方为：1 20％、亮氨酸20％、甘露醇60％，溶于去离子水中配成2％的溶液，喷雾干燥制得体积平均径为(2.907±0.105)μm、休止角为(29.2±2.0)° 的微粉，产率为(58.1±3.2)％。使用Aerolizer® 吸入装置对
装入胶囊的微粉进行雾化分散，测得其微细粒子分数为(36.2±2.8)％。大鼠肺部刺激性试验表明该微粉无明显肺部刺激性。
肺组织分布试验表明1 微粉肺部给药后大鼠肺部活性代谢产物奥司他韦羧酸含量高于口服同剂量1 微粉溶液组。提示本研究制得的1 微粉吸入后对呼吸道病毒感染可能会比口服发挥更好的治疗作用。
关键词：
磷酸奥司他韦；奥司他韦羧酸；肺部可吸入微粉；肺组织分布
2009 年3 月在墨西哥爆发的H1N1 病毒引起的
“人感染猪流感”，是一种由甲型H1N1 流感病毒引起的人体急性呼吸道传染疾病，截至2009 年8 月6日，该疫情已造成18 499 人死亡[1]。虽然2010 年8 月，世界卫生组织宣布甲型H1N1 流感已进入后流行期(post-pandemic period)，但这并非意味着甲型H1N1 流感已经远去，根据以往流行病的发展规律，在今后的数年中甲型H1N1 很可能转变为常规的季节性流感影响人类，而且可能发生H1N1 流感的局部爆发[2]，人类依然生活在甲型H1N1流感的阴霾中。
抗流感药物目前有两类：M2 离子通道阻滞药( 金刚烷胺类) 和神经氨酸酶抑制剂[3]。金刚烷胺类药物对乙型流感病毒无效，很多病毒株已对该类药物产生耐药性。神经氨酸酶抑制剂不仅对甲型流感病毒有效，对乙型流感病毒同样具有较好的作用，且其抗病毒能力显著强于金刚烷胺类药物[4—5]。神经氨酸酶抑制剂包括磷酸奥司他韦( oseltamivirphosphate，1，商品名达菲)、扎那米韦以及帕那
米韦[ 6—7]。其中，1 被列为我国流感病毒感染治疗
的首选药物，同时世界卫生组织也将其推荐为人禽流感预防和治疗的储备药品。1 是一种前药，在体内酯酶作用下水解成活性代谢产物奥司他韦羧酸(oseltamivir carboxylate，2，图1)，可以抑制流感病毒神经氨酸酶的活性[8]。
流感病毒在人体内必须与细胞表面的唾液酸受
体结合[9]，由于唾液酸受体仅存在于人体的呼吸道，因此流感病毒主要攻击人体呼吸系统。已有研究显示流感病毒致死的小鼠体内，肺脏中的病毒含量明显高于其他脏器[ 10]，所以在治疗流感方面抗病毒药物的吸入给药有可能比口服或静脉给药有更好的表现。目前，已有神经氨酸酶抑制剂类药物的粉雾剂上市。依乐韦是葛兰素史克公司开发的扎那米韦吸入粉雾剂[11]，而1 仅有胶囊剂上市。另外，1 胶囊口服后，可能造成消化道不良反应，包括恶心、呕吐、腹泻、腹痛等，以及中枢神经系统的不良反应，如眩晕、头痛、失眠、疲劳等。1 粉雾剂可将药物直接输送到呼吸道发挥药效，避免药物与消化道的接触，减少药物胃肠道吸收后的全身分布，也就有可能在降低消化道和中枢神经系统不良反应的同时提高疗效，达到高效、减轻不良反应的目的。
本研究拟制备用于肺部吸入给药的1 微粉，并对其理化性质、肺部刺激性以及肺部活性代谢产物2 的分布进行研究，以提高1 抗病毒效果，减轻其全身不良反应。
1 仪器与试药
2 方法与结果
2.1 1 和2 的HPLC 分析法
2.2 正交设计优化1 微粉的处方与工艺
采用喷雾干燥法制备1 微粉。采用甘露醇为填充剂，亮氨酸为雾化剂。将1、甘露醇与亮氨酸溶于一定量去离子水中，配成药物和辅料总浓度为2％的溶液，喷雾干燥即得1 微粉。
在前期工作基础上，本试验继续利用正交设
计优化微粉的处方与工艺。前期单因素试验表明亮氨酸含量低于10％时微粉流动性较差，而含量高于30％后喷雾干燥前难以溶解，因此亮氨酸含量范围设定为10％～ 30％；当入口温度低于100 ℃时，微粉在喷雾干燥仪中可能会因干燥不完全产生严重黏壁现象，而高于140 ℃时可能由于静电也会产生严重黏壁，因此温度范围定为100 ～ 140 ℃；当泵速超过2.50 ml/min 时，由于泵速较大会导致干燥不完全，而泵速太慢则工作效率低，因此在正交试验中泵速范围设定为0.83 ～ 2.50 ml/min。利用正
交设计考察的处方与工艺参数包括处方中亮氨酸的
浓度、喷雾干燥入口温度及喷雾干燥的输液泵泵速。表1 为正交设计各因素的低中高水平。通过微粉的产率、休止角、松密度和微细粒子分数(FPF) 对微粉的处方和工艺进行评价。
各指标的测定方法如下。
产率：收集旋风分离器中的产物，精密称定，
计算其与原辅料总重的比值，即得。
松密度： 取一干燥的5 ml 量筒， 精密称定(m1)，加入一定量制得的粉末，精密称定(m2)。从量筒刻度读得量筒中粉末体积(V)。计算松密度[ 即(m2-m1)/V]。
休止角：取一口径6 cm，管径( 内径) 约0.4 cm
的小漏斗一个，固定于铁架台上，漏斗下方铺一张坐标纸，漏斗的下端与坐标纸的高度定为4 cm，将粉末从漏斗上方缓缓倒入漏斗，待漏下的药粉接近漏斗出口时，测量该药粉圆锥体的高度和下端直径，据此计算出休止角的正切值，并进一步计算休止角。
FPF 值：精密称取制备得到的1 微粉20 mg，
填装于5 号明胶胶囊中，使用Aerolizer® 吸入装置对胶囊中的微粉进行雾化分散。照中国药典2015年版四部通则0951 中收载的装置1( 双级撞击器) 及规定的试验条件测定粉末的微细粒子剂量(FPD)，并根据FPD值计算微粉的FPF值( 公式① )。
表2 为正交设计的试验安排和结果。
照图2 方法对各指标进行数值归一化评分。其
中产率和FPF 值将各次试验中测得的最大值评分为1，测得的最小值评分为0，中间值分数根据式②计算。而休止角和松密度，将各次试验中测得的最小值评分为1，测得的最大值评分为0，中间值分数根据式计算。根据经验，将微粉产率和FPF 的权重定为2，松密度和休止角权重定为1，通过综合指标对微粉的处方和工艺进行优化( 式④ )。
各因素对综合指标的影响趋势见图3。极差分
析表明，亮氨酸浓度对产物综合指标影响最显著，其次为入口温度和泵速。由图3 可知，亮氨酸浓度为20％时，微粉综合性能最好。入口温度为120 ℃时可以制得性能较好的微粉。而泵速在0.83 和2.50 ml/min 时微粉性能均较好。从制备效率考虑，泵速宜定为2.50 ml/min。因此优化得到的微粉处方为：1 20％、亮氨酸20％、甘露醇60％。优化得到的微粉制备工艺如下：将原辅料溶于一定量去离子水中，得到原辅料浓度为2％的溶液进行喷雾干燥；喷雾干燥参数为：入口温度 120 ℃，泵速2.50 ml/min，旋风强度 100％，雾化风速 600 L/h，收集旋风分离器中产物即得1 微粉。采用正交试验优化的处方和工艺制备的1 微粉，产率为( 58.1±3.2)％ ( n=3)，说明该制备工艺可以得到较高的收率，能够有效减少药物的损失。
2.3 1 微粉的理化性质表征
2.3.1 松密度、休止角
松密度：制备3 批样品测量其松密度，结果显
示制得的1 微粉松密度为(0.19±0.01)g/ml，表明微粉结构松散，有利于雾化分散。
休止角：实验测得1 微粉休止角为(29.2±2.0)°
( n=3)，说明该处方和工艺制备的1 微粉流动性良好，有利于工业生产中的胶囊填装，可以更好的保证填装的重量差异。
2.3.2 粒径分布
采用激光粒径测定仪，以1,2- 丙二醇为分散
介质测定制备的1 微粉粒径。重复测定3 批微粉，所测得的粒子体积径d10、d50 和d90 分别为(1.185±0.130)、(2.969±0.213) 和(8.030±0.065)μm，体积平均径为(2.907±0.105)μm。图4 为制得的微粉的粒度分布图。
2.3.3 粒子形态
将制得的微粉于红外灯下略干燥，取少量样品
置铜片上镀金(15 ～ 20 nm)。用扫描电镜观察粒子的微观形态( 图5)，加速电压设为15 kV。从图5可知，制备的微粉无明显聚集现象，表面光滑，形态圆整。
2.3.4 FPF 值
照“2.2”项下方法，采用Aerolizer® 吸入装置
对粉末进行雾化。测得1 微粉的FPF 值为( 36.2±2.8)％ ( n=3)，表明该微粉雾化性能较好，部分药物可以随人体呼吸到达肺部。
2.3.5 粉末再分散性研究
图6 为在相对湿度(RH) 75％环境下(25 ℃ )
放置5 d 后，1 粉末的FPF 值。结果表明此条件下，未灌装和已灌装到明胶胶囊中的1 微粉的FPF 值较新制备的样品出现了显著下降，其原因是1 微粉发生了团聚。而保存在HPMC 胶囊中的1 微粉，其FPF 值较新制备的样品无显著性差异，其原因是HPMC 胶囊可有效隔离胶囊外水分向胶囊内部渗透。以上结果表明本试验制备的1 微粉在严密包装
阻隔外界水分的条件下具有较好的再分散性。
2.4 1 微粉肺部刺激性考察
取清洁级雄性大鼠15 只，随机分为3 组，分
组和给药剂量见表3。采用口腔可视气管插管法对大鼠进行气管插管[12—13]。具体方法为将大鼠用乌拉坦麻醉(0.8 g/kg，腹腔注射)，固定于角度约为45° 的手术台上，用2 mm 铁丝牵引上门齿，用压舌板撑开大鼠口腔，在大鼠颈部5 cm 处安置40 W 的白炽灯，打开白炽灯，光线即可穿过颈部皮肤及气管壁，此时可清楚看到大鼠声门随着呼吸开启与闭合，趁大鼠吸气瞬间将12 号小鼠灌胃针插入气管。将含有微粉的塑料软管连接灌胃针尾部，在塑料软管另一端连接一注射器，用注射器将微粉轻轻吹入
大鼠肺部。连续给药7 d，d7 给药后股动脉放血处
死大鼠，分离肺组织，置35％甲醛液中固定，染色，制作病理切片，观察肺组织损伤情况。图7为给药7 d后，各组大鼠的肺脏病理切片图。由图7 可知，对大鼠给予含药微粉和空白微粉7 d 后，同空白组相比，大鼠肺部未见明显炎性反应。结果表明本试验所制得的1 微粉无明显肺部毒性。
