RNA分子作为生命体内重要的生物大分子，其结构多样性和动态性直接决定了其功能。近年来，RNA因其在基因调控、新型生物技术开发以及药物设计中的潜在应用引起了广泛关注。然而，由于RNA分子通常具有异质性和高度动态性，现有的主流结构解析技术如核磁共振（NMR）、X射线晶体学及冷冻电子显微镜（Cryo-EM）难以全面揭示RNA的动态构象。同时，现有的研究中缺乏大型RNA结构数据库，RNA序列和结构间的直接关联尚不明确。用于预测蛋白质结构的方法如AlphaFold也无法应用于RNA的三维结构预测。近日，美国国家癌症研究所的Yun-Xing Wang教授在Nature发表了题为The conformational space of RNase P RNA in solution和Determining structures of RNA conformers using AFM and deep neural networks两篇研究论文。RNase P是一种存在于所有生命领域的唯一反式作用RNA酶，其功能包括修饰前体转运RNA（pre-tRNA）的5′末端，以及处理与癌症相关的长链非编码RNA MALAT1等其他RNA分子。RNase P RNA具有显著的底物多样性和适配能力，但其同时需要一定的结构刚性来维持酶促反应的精准性。这种灵活性与刚性的相互作用如何实现？因此，在这项研究中，研究人员展示了利用单个分子的原子力显微镜（AFM）图像和机器学习方法绘制来自嗜热脂肪地芽孢杆菌（Gst）的全长RNase P RNA的构象空间。结果通过对宽构象空间的采样为该RNA的底物混杂和催化低效提供了结构动力学基础，同时提供了一种展示RNA构象动力学的新方法。首先，研究人员通过体外转录技术获得了完整长度的 RNase P RNA，样品在1 mM Mg²⁺下通过AFM得到RNA分子的三维拓扑结构，分辨率达到了 10–15 Å。通过利用深度学习算法HORNET对AFM图像数据进行处理，成功重建了158个独立分子的三维结构。在构象动态分析中，其构象空间涵盖了紧凑型（C1）、中间型（C2）和展开型（C3）三种主要类别。C2型为主体，占比达75%。通过 PCA提取了构象变化的主要动态方向和振幅，进一步分析了 RNA 分子在不同条件下的运动模式。同时，为了探索RNA序列与其动态特性之间的关系，研究团队计算了 RNA 序列的保守性（sequence conservation score, SCS）与三维构象稳定性（3D conformation conservation score , 3DCS）之间的相关性分析，发现序列保守性高的区域（如催化核心）通常对应较低的动态性，而某些高度动态的区域（如P10.1和P12）也具有保守的序列特征，表明动态灵活性可能对底物适配性至关重要。在第二篇论文中，研究人员开发了一种能够解析RNA分子动态异质性的方法（HORNET），即利用AFM捕捉RNA单分子在溶液中不同构象的拓扑信息，结合无监督机器学习（Unsupervised Machine Learning, UML）与深度神经网络（Deep Neural Networks, DNN），基于伪结构数据库（psDatabase）进行训练，并通过六个基准案例验证其精度，提供顶级结构的均方根偏差（r.m.s.d.）评估。研究人员进一步应用HORNET，成功解析了全长RNase P RNA的三种新结构和HIV-1 RRE的五种新构象。以RNase P RNA为例，研究人员展示了如何通过AFM图像结合动态拟合方法，确定RNA分子三个不同构象状态（P1、P2和P3）。通过应用低通傅里叶滤波器，P1、P2和P3图像的分辨率分别为11.5 Å、11.1 Å和12.5 Å。虽然图像分辨率都约为 12 Å，但RNA的结构特点使得AFM成为研究异质性RNA结构和动力学的理想工具。紧接着，研究人员利用UML方法分析了BM0轨迹模型的r.m.s.d.值，发现大量模型接近真实结构（PBD ID: 3DHS），但其构象与真实结构存在差异。为此，研究中引入了结合三类信息的UML方法：(1) 与初级化学结构、二级和三级结构相关的能量；(2)CCAFM分数；(3)与AFM拓扑约束相关的能量成本（AFM偏置势）。结果表明，使用UML方法，经过动态拟合的模型在不同噪声水平下的r.m.s.d.值均保持在约5 Å左右，表明拓扑约束在构象分析中的重要性。RNA结构预测面临的主要挑战是分子异质性和缺乏结构-序列相关性。利用DNN方法，通过结合RNA结构模型的能量信息、AFM拓扑图（CCAFM）和拓扑约束，创建了一个包含超过350万个RPR催化结构域模型的伪结构数据库（psDatabase），成功训练出了高准确度的模型。最后，研究者通过 HORNET 方法分析 HIV-1 RRE RNA 的构象异质性。在AFM下观察到五种不同RRE构象，验证了其灵活性和异质性。AFM可视化显示，RRE折叠成多种“A”形状，验证了此前基于SAXS数据推导的分子包络。综上所述，本研究为RNA结构生物学领域开辟了新方向，尤其是在揭示RNA构象多样性和功能相关性方面具有重要意义。未来，结合更大规模的RNA结构数据库与更高分辨率的AFM成像技术，HORNET有望进一步提升解析能力，推动RNA分子在基础研究和应用领域的广泛应用。原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07559-x
https://www.nature.com/articles/s41586-024-08336-6
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