斯坦福大学创业团队 2024 年 12 月在《International Journal of Molecular Sciences》发表题为「Efficient mRNA Delivery In Vitro and In Vivo Using a Polycharged Biodegradable Nanomaterial」 的文章，系统性地报道了一种新型的生物可降解载体材料在 RNA 转染领域的应用及其使用方法优化过程，这种材料能通过简便的实验步骤实现高效的 RNA 递送，并同时适用体外和体内的转染需求，本文为该技术的科研和工业使用者提供了明确的操作指南。伴随基因科学与治疗技术的迅猛进步，基因疗法正日益成为预防和治疗遗传病、传染病以及肿瘤等重大疾病的前沿创新手段。近年来，多种细胞和基因治疗药物相继获批上市，显示了该领域的蓬勃发展与巨大潜力。作为基因治疗技术的核心环节，高效且安全的基因递送系统的开发至关重要，不仅能有效保护基因载荷的完整性，还克服了体内递送过程中复杂的生物屏障，为实现基因疗法的临床转化提供关键支撑。病毒载体（如 AAV 和 rAAV）虽已广泛用于基因治疗，但其局限性依然明显，包括免疫反应风险、潜在的插入突变风险、基因递送尺寸受限制以及生产成本高昂等问题。相比之下，非病毒递送系统凭借更低的免疫原性和更高的安全性，逐渐成为具有广阔前景的替代方案。然而，目前市场上用于基因转染的现有产品（如 Lipofectamine 系列产品、FuGENE 和 JetMESSENGER 等）虽在体外 RNA 递送中表现出一定效果，但其在某些细胞中的转染效率较低，同时难以在体内实现安全且高效的基因递送。因此，迫切需要开发一种兼具体外和体内应用能力，并能实现高效、安全转染的递送载体，以满足学术研究和工业研发对高性能基因递送系统日益增长的需求。N1-501 具有以下关键优势：
通过在 18 种不同细胞系和小鼠模型中的评估，N1-501 展现出稳定且高效的转染性能。这些实验涵盖了多种实验变量，包括生理缓冲液成分的差异、pH 范围（4.0–8.0）、孵育温度（0–37 °C）、孵育时间（0–60 min）、培养基类型以及血清耐受性。
N1-501 的开发为基因治疗领域提供了一个可加速从实验室研究到临床前研究过渡的高效解决方案。它不仅能降低研发成本，还能显著提高转化成功率，为基因治疗的进一步推广与应用开辟了新路径。N1-501 在多种细胞系的转染实验中都显示出良好的转染效果和安全性。为了评估其 mRNA 递送性能，研究人员选择了 18 种常用的细胞系，并使用商用转染试剂 Lipofectamine 3000 作为对照（图 1A, 1B）。N1-501 在所测试的上皮细胞系和成纤维细胞系中表现出优异的转染效率（表 1）。在 RAW264.7 细胞中，超过 80% 的细胞表达了 GFP 蛋白，这一递送率对于难转染的免疫细胞系来说尤为突出。值得注意的是，与 Lipofectamine 3000 相比，N1-501 在所有筛选的细胞系中均表现出更高的 eGFP 表达水平（图 1B）以及更快的表达速率。不仅如此，N1-501 的安全性也在大多数癌细胞、脑细胞和成纤维细胞系中得到了验证。总体而言，N1-501 在多种细胞系中表现出优于 Lipofectamine 3000 的转染能力。图 1. N1-501 能够更加高效地将 mRNA 递送至多种细胞系中，并表达成蛋白质表 1. N1-501 可将 mRNA 递送至多种细胞中N1-501 与其他体外转染试剂不同，它可以同时实现体内体外的转染。研究人员通过尾静脉注射的形式评估了 N1-501 在体内系统性递送荧光素蛋白 mRNA 的性能。在给药后 3、6 和 12 小时注射 D-荧光素，并对小鼠进行全身成像以评估各时间点的荧光素酶蛋白表达。结果表明，N1-501 给药组在所有时间点均表现出优异的脾脏选择性 (图 2A)，总荧光信号在 3 到 12 小时之间逐渐减弱 (图 2C)。离体成像进一步证明了 mRNA 递送的器官和组织选择性。荧光信号主要分布在脾脏、肺和肝脏中，其中脾脏的荧光强度比肺和肝脏高出两个数量级，说明 N1-501 在 mRNA 递送方面具有显著的脾脏靶向能力 (图 2B)。图 2. N1-501 体内转染高效安全，且表现出显著的脾脏靶向性
N1-501 可以通过简单的移液枪混合方法包封 mRNA（如图 3 所示），也可以使用振荡器辅助混合和包裹。其良好的水溶性特征使整个配制过程能够在水相系统中进行，无需添加任何有机溶剂或缓冲液。将 N1-501 与稀释后的 mRNA 在无 RNA 酶水中混合后，纳米颗粒可通过自组装形成，样品在室温下预孵育 3 分钟后即可用于细胞转染。体内制剂需调至 1X PBS 浓度再用于动物实验。与移液枪混合法相比，振荡混合法能提供更均一的粒径。两种方法均易于操作，可以在标准的实验室条件下进行。N1-501 在 RNA 递送方面提供了广泛的操作窗口，适用于各种剂量范围 灵活适用于不同的 RNA 剂量范围细胞转染率、mRNA 表达水平和细胞活力是评估 mRNA 转染的三个关键标准。RNA 剂量在不同应用中会根据研究目标和实验设置有很大差异。为了探索安全窗口和功效范围，研究人员在 HEK 293T 细胞中测试了不同的 mRNA 和 N1-501 剂量组合，以观察不同剂量对于 RNA 转染的影响。结果显示，GFP 蛋白表达水平（以平均荧光强度，MFI 表示）与 mRNA 剂量呈正相关性（图 4A）。如果 mRNA 剂量过高，可通过降低 N1-501/mRNA 比例以平衡功效和安全性。值得注意的是，N1-501 在所测试的所有 mRNA 剂量条件下的转染效率均在 96% 以上（图 4B）。这些结果可为研究人员提供参考，以确定特定应用场景中的边界条件和最佳剂量范围。图 4. N1-501 在不同 mRNA 和载体剂量组合下的转染性能和安全性适用于多种缓冲液和培养基条件，以满足不同的研究需求生理缓冲液在基因递送中也起着多种作用，比如基因载荷和制剂的储存、配方工艺开发等。具有特定 pH 范围的缓冲液对维持基因载荷的稳定性和功能至关重要。它们还会影响可离子化递送材料的电荷，从而影响纳米颗粒的包封效率、粒径、均一性和稳定性。在本作者在配方开发过程中测试了四种常见的生理缓冲液 —— 柠檬酸盐（pH 4.0、5.0 和 6.0）、醋酸盐（pH 4.0、5.0 和 6.0）、磷酸盐缓冲盐水 (PBS，pH 7.4) 和 HEPES（pH 8.0）。由 N1-501 递送的 eGFP mRNA 在细胞内的表达水平显示出明显的 pH 依赖性：在 pH 6.0 的柠檬酸盐缓冲液中制备的纳米颗粒产生了最高的 MFI，在 pH 5.0 和 pH 4.0 中信号依次减弱 (图 5A)；醋酸盐缓冲液显示出类似的趋势。在 pH 7.4 的 PBS 和 pH 8.0 的 HEPES 缓冲液中的 MFI 与在水中的表现相近。值得注意的是，转染效率在所有缓冲液和 pH 条件下无显著性差异（图 5B），表明 N1-501 在各种缓冲体系下具有良好的稳定性和适应性。N1-501 还具有良好的血清耐受性。血清可能会引入 RNA 酶污染、或与载体竞争细胞表面受体阻止其进入细胞、或影响载体/mRNA 复合物的稳定性，从而干扰 mRNA 转染。因此，实验中通常会使用无血清或降血清的培养基（如 Opti-MEM）以获得最佳的转染性能。然而，这些条件对于需要维持一定血清浓度的应用和（或）细胞系不适用。本研究中，N1-501 能够在有血清的条件下成功转染细胞，且不同缓冲液体系、pH 范围和培养基条件对细胞活性基本没有影响，证明了 N1-501 在各种配制和处理条件下具有良好的安全性。图 5. N1-501 在配制和转染过程中缓冲液及培养基的兼容性纳米颗粒配方的稳定性和可重复性对于 mRNA 转染实验至关重要。稳定的纳米颗粒能够保持 mRNA 的完整性，并能简化制剂的使用和运输。此外，稳定的制剂还可以支持时间密集型任务，例如高通量实验和需要用同一个样品进行多种实验的情况。稳定且一致的配方不仅能保持转染效果，还能提高实验成功率，确保结果的可靠性和可重复性。结果表明，在 0 °C 或 25 °C 下孵育长达 60 分钟的 N1-501/mRNA 复合物作用于细胞后转染效率仍然超过 98%（图 6B）；样品在 37 °C 下孵育一小时后，表达 GFP 蛋白的细胞比例仍保持在 95% 以上。各条件下恒定的高转染效率表明 N1-501 材料包裹 RNA 的能力卓越，可以确保纳米颗粒优异的稳定性和重复性，可适应高通量实验、转化研究或其他复杂研究中可能出现的不均一性。图 6. N1-501 与 mRNA 样品制备后在三种不同温度下预孵育不同时间不影响转染效果本文基于体外转染效率评估了 N1-501 的保质期。不同于一些市售的 LNP 技术相关的载体分子，例如阳离子脂质等分子，N1-501 及储备液（2.5 mg/mL，无 RNA 酶水）不需要在-80 °C 下储存。 常规使用情况下，N1-501 储备液可保存在 4 °C 下，而长期内不使用则可以放置于-20 °C 下保存（超过 5 年）。 与 Lipofectamine3000 不同的是 N1-501 储备液经过多次冻融后（>30 次）仍然保持其生物活性即出色的 RNA 转染能力。此外，室加速稳定性实验结果表明 N1-501 在 4 °C 下可保存至少两年时间。图 7. 基于体外转染效率的 N1-501 保质期评估N1-501 作为一种新型 RNA 递送材料，在多方面展现了其优异的特性，在体内和体外、不同的实验条件、不同的保存条件下均能保持稳定高效的 RNA 转染能力；其制备过程简单，可在标准实验室条件下完成，且制剂在一定温度范围（0–37 °C）下保持稳定，确保了实验结果的一致性和可重复性，同时简化了操作流程。N1-501 能兼容多种生理缓冲液，适应广泛的 pH 范围（pH 4.0–8.0），且在 mRNA 转染过程表现出血清耐受性，增强了其在复杂生物环境中的实用性。值得注意的是，在一定范围内，无论 RNA 剂量高低，都可通过调整 N1-501 的使用比例实现高效的转染效率，拓展了其在不同递送需求下的应用潜力。N1-501 的转染效果优于商业试剂 Lipofectamine 3000，能够高效转染多种细胞系，包括上皮细胞、成纤维细胞和脑细胞，展现了其广泛的有效性。N1-501 在基因编辑方面也表现出色，在体外递送 Cas9 mRNA 和 sgRNA 时，编辑效率高达 96%。更重要的是，N1-501 在体内系统性递送 mRNA 中表现出优异的脾脏靶向性，这一独特性使其在桥接实验室研究与临床应用的转化过程中有多重优势，有望加速 RNA 疗法和技术的研究和开发。Yang, X.; Xiao, J.; Staveness, D.; Zang, X. Efficient mRNA Delivery In Vitro and In Vivo Using a Polycharged Biodegradable Nanomaterial. Int. J. Mol. Sci. 2024, 25, 13620. https://doi.org/10.3390/ijms252413620
