Plus深读|长期吸烟，引发肺癌的可能不只是突变！

在这篇文章里，约翰霍普金斯医学院（The Johns Hopkins University School of Medicine）的研究人员用数据证明，吸烟的危害是长期积累的，能够通过改变表观基因组，加速细胞转变，联合基因突变引发恶性肿瘤。

论文解读

1：CSC长时间处理影响DNA甲基化酶、DNA甲基化、以及HBECs细胞形态

首先，研究者证明CSC处理能够影响表观遗传调控蛋白的水平，如Fig.1A-B，CSC处理10d后，DNMT1水平上升；在6-10个月后再次上升。

相应的，DNA甲基化测序发现，CSC处理10-15个月后，HBECs中DNA甲基化水平也相应提高；这种提高在CSC处理6个月及以后才能显现，处理早期比如10d时不会有什么变化（Fig.2）。有意思的是，这些甲基化存在的区域，多是分布在转录起始位点（TSS）以及启动子区域的CpG岛上（Fig.2D），这些区域一般在调控基因的表达上起作用，提示CSC处理引起的表观遗传修饰变化具有生物学功能。

与DNA甲基化变化相一致，HBECs的细胞形态，也在CSC处理6个月到10个月以后，开始出现与正常细胞明显的不同（Fig.1D），证明了表观遗传修饰的变化造成了一定水平上生物学性状的变化。

Fig.1 CSC处理引起表观调控蛋白水平变化

Fig.2 CSC处理导致DNA甲基化变化

2：CSC处理引起部分非小细胞癌相关基因的DNA甲基化水平提高

CSC处理1、6、10、15个月后，HBECs细胞中，TSS位点上下游1.5kb之内的CpG岛处DNA甲基化水平变化，主要发生在10-15个月以后（Fig.3A）。选择其中CSC处理后DNA甲基化上调的基因，与肺鳞癌和肺腺癌中甲基化变化的基因有大量重合（Fig.3C）。

Fig.3 TSS位点附近甲基化分析

3：CSC长期处理引起抑癌基因和全基因组水平TSS区域的DNA甲基化，抑制表达

3个已知的抑癌基因（BMP3，SFRP2和GATA4）DNA甲基化、组蛋白甲基化等表观遗传修饰都发生变化。ChIP-PCR发现，这些抑癌基因的启动子上：

1）CSC处理初期（10d），EZH2结合上升，H3K27me3水平上升；而DNMT1不变（Fig.4A）

2）CSC处理3个月后，直到10个月，DNMT1水平上升，相应的DNA甲基化取代组蛋白甲基化，成为主要的表观遗传标记（Fig.4A）

由于DNA的甲基化，这些抑癌基因表达水平在CSC处理10个月后降低（Fig.4B），提示CSC长期处理后，细胞对于癌变的管控“闸门”已经松懈。

研究者扩大对象，利用ChIP-seq，证明CSC长期处理后全基因组水平上TSS区域的DNA甲基化都有所上升（Fig.4C）。由此研究者假设，CSC处理会从表观水平改变关键基因的转录调控模式，即由PRC2等组蛋白修饰调控转变为DNA甲基化水平的调控。

这种转变是一个长期的过程：和DNA甲基化的进程一样，长期处理才能发生，发生之后同样能长期稳定的发挥作用，而难以扭转。

附：抑癌基因功能研究：

BMP3：能够抑制RAS-MAPK通路；非小细胞癌（NSCLC）中甲基化水平提高、表达下降，经常与KRAS突变共存

WNT通路抑制蛋白，比如SFRP1/2，DKK1-3，以及MSX1—促进抑制蛋白的表达。

Fig.4 CSC处理导致的ChIP PCR和表达变化

4：CSC影响HBECs细胞学性状、在KRAS突变下导致肿瘤

CSC处理10-15个月的HBECs变得更像肿瘤细胞：

1）导致细胞EMT、贴附性下降等生理变化（Fig.6A-E）

2）KRAS过表达后转变为肿瘤细胞（Fig.6H-I）

之前的研究发现，HBECs成瘤转化至少需要以下三个基因的变化：

TP53下调，KRAS突变，和c-MYC的过表达

如果先将HBECs用CSC处理15个月，则只需要KRAS的过表达（V12），就可以致瘤（Fig.6H-I），证明CSC处理导致的表观遗传学变化，相对于单基因突变，会大幅度提高致癌可能性。

3）将CSC处理15个月、并感染KRASV12的HBECs进行成瘤实验，发现肿瘤兼具腺癌和鳞癌的分子标记（Fig.7B）；细胞内的DNA甲基化水平升高（Fig.7C）、相应基因表达水平降低（Fig.7D）。这些细胞中，WNT、LEF1、Hedgehog等通路水平会上升，符合癌变细胞的理化性质（Fig.7E）。

肺癌患者中常常出现的3个基因的突变：EGFR、KRAS和TP53；其中EGFR主要与不吸烟的LUAD患者相关，而KRAS和TP53则是吸烟者会引起的突变；吸烟者中，则是KRAS的突变与吸烟行为本身更有联系（Fig.7F-G）。

总之，本研究中CSC的长期处理，可以模拟长期吸烟，会导致肺上皮细胞转化、变得更有干性，细胞形态和增殖等都出现变化；仅需辅以单基因-KRAS的突变，就会导致不处理条件下多基因突变才会细胞癌变。

Fig.6 CSC长期处理改变细胞性状

Fig.7 CSC长期处理细胞体内成瘤

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