随着基因组学研究不断深入以及基因改造工具的日益成熟，植物基因工程和育种正在进入一个快速发展的时代。利用基因编辑工具可以实现精确的遗传改良，从而改善作物表型。目前，将基因编辑元件递送到植物细胞中最常见的方法是农杆菌介导的遗传转化方法，但这种方法需要通过耗时且复杂的植物组织培养和再生过程来获得基因编辑材料，阻碍了双子叶和单子叶植物基因组编辑的常规应用。针对没有转化体系或遗传转化操作复杂且困难的物种，开发无需组织培养或不受基因型限制的递送系统是植物基因编辑亟待解决的关键技术问题。近些年，研究者们通过多方面的测试已经开发出了一些新的系统，可以将基因编辑元件输送到植物胚性或分生组织细胞中，并在不需要组织培养的情况下实现基因编辑。接下来，就和小远一起来看看具体的内容吧。

利用单倍体诱导系的花粉来递送基因编辑元件已在玉米、小麦、谷子等禾本科作物中有相关的报道(Budhagat apalli et al., 2020; Kelliher et al., 2019; Wang et al., 2019)，但利用双单倍体诱导系进行基因编辑还未在双子叶作物中有相关的报道。

2021年5月，中国农业科学院油料作物研究所胡琼课题组和成都农林科学院付绍红课题组联合在 Plant Biotechnology Journal 杂志上发表了一篇题为“Direct Modification of Multiple Gene Homoeologs in Brassica oleracea and Brassica napus Using Doubled Haploid Inducer-Mediated Genome Editing System”的研究论文，该研究报道了一种不依赖遗传转化的甘蓝和油菜基因编辑技术，通过直接授粉的方式对甘蓝和油菜的基因进行编辑，即可获得不含转基因成分的突变体材料。

在该论文中，作者首先将基因编辑载体转化到芸薹属双单倍体诱导系Y3380中，然后利用Y3380作为基因编辑元件的传送介质，通过授粉的方式对育种材料甘蓝X1和油菜ZS7的 FAD2 基因进行基因编辑。在甘蓝和油菜的后代中，可以检测到多个同源序列发生编辑，且产生的突变可以稳定遗传。此外，结合流式细胞术检测发现突变体材料的倍性分别与其母本（甘蓝X1或油菜ZS7）一致，因此后期不需要再进行人工加倍。总之，该方法可以有效的克服基因型依赖性，加速甘蓝和油菜的基因功能研究。

烟草脆裂病毒（Tobacco rattle virus, TRV）是一种正链RNA病毒，由其诱导的基因沉默是目前应用最为广泛的一类基因沉默体系。利用TRV载体同样可以将sgRNA递送至稳定表达 Cas9 基因的植株中进行编辑，但是这种方法在体细胞中的编辑效率较低(Ali et al., 2015)，那么是否有改进的可能呢？

2020年6月，明尼苏达大学Daniel F. Voytas课题组在 Nature Plants 杂志上发表了一篇题为“Multiplexed heritable gene editing using RNA viruses and mobile single guide RNAs”的研究论文，该研究开发了一种使用TRV载体表达可移动的sgRNA，在植物中实现高效基因编辑的方法。

在该论文中，作者基于先前的研究报道，了解到FT在叶片维管束组织中进行转录后，会转移至茎尖分生组织诱导植物开花(Jackson et al., 2012)。因此假设，将FT与sgRNA融合，那么sgRNA就有可能随FT从叶片向茎尖分生组织移动，并以较高的效率产生可遗传的基因编辑。

为了验证sgRNA能否随FT移动，作者将FT与靶向烟草 PDS 基因的sgRNA融合后一起构建到了TRV载体中。借助农杆菌侵染将载体转入表达 SpCas9 的转基因烟草叶片中，培养约2.5周后烟草新生叶片上开始出现白色斑点，随着植株的不断生长，这种表型在新叶上更加突出。这一结果表明该方法可以成功的在烟草上起作用，高通量测序结果也表明烟草上出现的白化表型是由于 PDS 功能缺失所致的。为了测试 PDS 的编辑能否遗传到下一代，作者对来自受感染亲本的幼苗进行了检测，结果显示约65％的后代幼苗中至少有一个 PDS 等位基因突变（图5）。

图5 使用TRV载体表达可移动的sgRNA进行可遗传的基因编辑(Ellison et al., 2020)。（a）TRV载体示意图；（b）利用改造后的TRV载体进行基因编辑的实验操作流程；（c）农杆菌侵染后约2.5周的本氏烟植株的表型；（d）农杆菌侵染后约10周的本氏烟植株的表型，左侧为对照组，右侧为实验组；（e）靶向 PDS 的移动sgRNA在侵染叶片上方第八片叶子中的编辑效率的统计结果；（f） P DS 基因突变在后代中遗传情况；（g）与普通的sgRNA相比，可移动的sgRNA可以产生更高比例的双等位基因突变和杂合突变；（h）本氏烟幼苗的 PDS 基因编辑表型；mFT：突变的FT，Truncated FT：截短的FT。

随后作者通过构建含有多个可移动sgRNA的载体，来测试该方法在多基因编辑中的作用。结果显示，在后代中可以鉴定到在多个目标基因座处发生突变的植物（图6）。

大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus, BSMV）是一种正链RNA病毒，由RNAα、RNAβ和RNAγ三部分组成。在先前的研究中，该病毒已被设计用于sgRNA的递送，并在 Cas9 转基因小麦以及玉米叶片中实现了对宿主基因的编辑(Hu et al., 2019)，但是其进行可遗传编辑的能力仍有待探索。

2021年7月，中科院遗传发育所王延鹏课题组和中国农业大学张永亮课题组联合在 Molecular Plant 杂志上发表了一篇题为“Highly efficient heritable genome editing in wheat using an RNA virus and bypassing tissue culture”的研究论文，该研究设计了一种基于BSMV的sgRNA递送载体BSMV-sg，在小麦中成功建立了高效、可遗传、不需要组织培养的基因编辑元件递送系统。

在该论文中，作者首先构建了一系列的BSMV载体，包括在sgRNA的5’或3’端连接tRNA和/或FT RNA移动元件的改造载体。将构建好的载体按照图7所示的接种流程，接种到处于营养生长中后期的 Cas9 转基因小麦中，待小麦结实后，对子代（M1代）植株进行基因编辑检测。高通量测序结果显示BSMV-sg载体系统可以在Bobwhite、Fielder和郑麦7698这三个不同品种的 Cas9 转基因小麦的不同靶点，实现高效的可遗传基因编辑，总体效率可达46.2%-68.9%。并且大部分发生编辑的子代植株中不含BSMV（图8）。为了测试该系统在多基因编辑中的效果，作者将携带不同sgRNA的BSMV-sg载体的农杆菌混合后，先接种到本氏烟草中，再用本氏烟接种叶片的提取物来侵染 Cas9 转基因小麦。对M0和M1代小麦的检测结果显示BSMV-sg可以在小麦中进行多重可遗传编辑。

图7 基于BSMV的基因编辑载体及小麦接种流程(Li et al., 2021)。（A）BSMV基因编辑载体示意图；（B）BSMV-sg介导的小麦基因编辑操作流程示意图。

由于BSMV载体容量有限，难以容纳编码Cas9蛋白的核酸序列。因此，该系统需要使用稳定表达 Cas9 基因的受体植株，为了将 Cas9 快速的分离出去，作者还开发了一种病毒诱导的无转基因编辑技术（VITF-Edit），通过将BSMV侵染的 Cas9 转基因小麦花粉与野生型小麦进行杂交，从而生成不含转基因成分的小麦突变体（图9）。

图9 通过将接种BSMV-sg的小麦与野生型小麦杂交获得不含 Cas9 的突变体(Li et al., 2021)。（A）病毒诱导的无转基因编辑技术（VITF-Edit）的实验流程示意图；（B）接种BSMV-sg的 Cas9 转基因小麦植株的花药中， TaPDS 、 TaGASR7 和 TaGW2 这三个基因被高效编辑；（C）接种BSMV-sg-TaPDS的小麦花药的白化表型；（D）VITF-Edit的F1后代中 TaPDS 的突变频率；（E）VITF-Edit中每个F1突变体中三个基因的突变频率；（F）F2代中无Cas9植物的蛋白质印迹分析。

目前，大豆基因编辑植株主要是通过农杆菌介导的遗传转化方法获得的。由于该方法的组织培养与再生过程繁琐且耗时，并且存在基因型限制。因此开发无需组培且不含外源DNA的大豆基因编辑系统，对于大豆的基因功能研究十分重要。

2024年9月，北海道大学Tetsuya Yamada课题组在 Plant Physiology 杂志上发表了一篇题为“A DNA-free and genotype-independent CRISPR/Cas9 system in soybean”的研究论文，该研究报道了一种用于大豆基因编辑的新技术，通过利用体内粒子轰击-核糖核蛋白（in planta bombardment-ribonucleoprotein, iPB-RNP）的方法，将CRISPR/Cas9系统的RNP复合物（Cas9蛋白和gRNA结合形成的具有编辑功能的复合物）直接递送到大豆茎尖分生组织（SAM）细胞中，进而实现基因编辑。

在该论文中，作者首先准备了胚轴，将发芽后的Yukihomare大豆种子子叶和初生单叶去除，使SAM暴露出来（图10），并将靶向 Gly m Bd 30K 的RNP复合物与金颗粒混合，使RNP复合物附着在金颗粒表面。随后，利用粒子轰击系统将涂覆RNP复合物的金颗粒轰击到大豆的SAM中。将轰击后的胚轴转移至MS培养基中培养至生根发芽，大约两周后就可以转移至土壤中种植直至成熟。利用酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences, CAPS）和测序对E ₀ 和E ₁ 代植株的突变情况进行检测，结果显示E ₀ 代的突变可以遗传到下一代（图11）。随后将iPB-RNP应用到Enrei、Fukuyutaka、Williams 82和Jack这四个大豆品种的基因编辑中，结果显示可遗传到E ₁ 代的突变频率约为所有E ₀ 植物的0.4%至4.6%。此外，作者还测试了iPB-RNP在多基因编辑中的作用，检测结果显示该方法可以在两个靶标区域内同时诱导突变。

图10 大豆下胚轴的SAM和Cas9蛋白递送的可视化(Kuwabara et al., 2024)。（A-D）大豆下胚轴，白色箭头指示的是SAM；（E-J）茎尖的扫描电镜结果，去除单叶后，大豆SAM在两天内形成了单个叶原基（LP）（F），随后又形成了其它的叶原基，之后毛状体开始覆盖SAM（I、J）；（K、L）茎尖共聚焦激光扫描显微镜拍摄的结果，通过观察GFP荧光定位来确定金颗粒的输送。

图11 利用CAPS和测序分析检测E ₀ 和E ₁ 植株的突变情况(Kuwabara et al., 2024)。（A、B、D）CAPS分析：E ₀ 叶片中的大量DNA的CAPS分析（A）；E ₀ （B）和E ₁ （D）叶片中的单个DNA分析；（C、E）测序分析：E ₀ （C）和E ₁ （E）植物中靶标及附近区域的测序分析。

大家都知道利用基因编辑工具可以实现精准的遗传改良，从而改善作物的营养、品质以及性状。但是，目前基因编辑技术的应用还受到很多因素的限制，因此开发无需组织培养且不受基因型限制的基因编辑载体递送方法，可以使更多的植物能够进行基因编辑。在本次推文中小远主要是和大家分享了四种无需组培的基因编辑方法，分别是利用嫁接、授粉、病毒载体和粒子轰击-核糖核蛋白的方法来获得基因编辑材料。相信未来还会有更多的新方法来助力基因编辑领域的发展，大家如果有新的资料也欢迎和小远一起分享哦~