【意外可变剪切】Cas9意外突变再添证据！华人科学家Genome Biology发文 大程

CRISPR广泛用于通过诱导小的插入和缺失来破坏基因功能 。华人科学家 Wen Xue 和著名生物信息学家 Zhiping Weng 在Genome Biology 发表题为：“CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by alternative splicing or exon deletion ”，发现一些 guide RNA （ sgRNA ）可以 诱导 外 显 子跳 跃 或造成 删 除外 显 子的大型基因 组 缺失。 例如，CRISPR编辑β-catenin 外显子3，诱导了外显子的部分跳跃和β-catenin的核积累。单个sgRNA可以诱导小的插入或缺失，其部分改变剪接或意外的较大缺失， 从而去除外 显 子，外 显 子跳 跃 增加了在 CRISPR 实验中必须考虑的可能的结果， 也许可以利用它们。

科学家们最近使用CRISPR在两个独立的肺腺癌细胞系中破坏了Kras癌基因，分离了两个单细胞克隆，每个克隆在外显子2中携带移码缺失：KP1在G12D等位基因中携带2-nt“-CG”缺失，1-nt“-C “在野生型（WT）Kras等位基因中的缺失;而KP2携带2-nt“-GG”缺失。两个克隆都不产生全长Kras蛋白， 表明所有三个缺失破坏了 Kras 阅读框 。

早期外 显 子中的 Frameshift 突 变 引 发 无 义 介 导 的衰 变 （ NMD ），其消除具有提前 终 止密 码 子的 mRNA 。

然而，当分析mRNA测序（RNA-seq）数据时，我们发现与亲代KP细胞相比，KP1细胞中Kras mRNA水平仅降低19％，KP2细胞中仅47％。两个克隆产生的外显子2读数较少，但正常水平的外显子1和3读数，表明外显子2可能会跳过KP1和KP2克隆。 实际 上， 检测 到外 显 子 1-3 连接读数，表明外显子 2 被跳 过 。 计算外显子2读数和总读数之间的比例，发现外显子2仅包含在KP1克隆的Kras读数的64.0±9.1％中。

在KP2克隆中观察到类似的外显子2跳跃Kras mRNA的逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）产生两个产物：一个对应于完整的Kras互补DNA（cDNA），另一个对应于外显子1-3同种型。外显子1-3同种型保留了可以启动从外显子3（附加文件1：图S2）中的ATG密码子翻译的部分Kras开放阅读框，并产生严重截短的KRas蛋白。

KRAS的编辑并没有诱导全基因组的剪接。 在KP1细胞中鉴定到97个可变剪接的外显子和KP2细胞中的177个。 KP1和KP2克隆共有22个包含或排除，除了Kras外显子2是两个克隆中最大的变化。因此， 编辑Kras外显子2特异性地引起Kras外显子2的跳过。 值得注意的是，小鼠KrasG12D（GGU至GAU）转录物不跳过exon2.