基因敲除： 我的老鼠只有我懂

如果是在做动物实验，而且是基因敲除鼠的实验，那么就会做大批量的小鼠基因型鉴定试验，来确定自己小鼠的基因型，然而，再做实验的过程中往往会出现一些意想不到的结果，我作为一只实验狗在这里为大家提一点点小建议。

提取DNA

1、组织提取DNA 剪下老鼠0.5-1.2cm尾巴或者耳朵或者称取20mg组织样本，将样本剪碎放在1.5ml的EP管中。

2、在每个EP管中加入275微升的裂解液（我们实验室使用的是promega的试剂盒）将加入裂解液的组织放在55摄氏度的水浴箱中过夜（16—18h）裂解完全的标志是组织完全溶解。

3、第二天振荡每一个EP管，混匀后再离心，转速13000rmp时间是3分钟，取上清分离毛发，将取的上清加到柱型管中（有滤网的小柱型管，柱型管套装在1.5的EP管中）。

4、在每个柱型管中加入250微升的Wizard SV lysis Buffer，此裂解液需要提前水浴30min，55摄氏度。

5、离心3min 转速13000rpm ，倒掉滤液。

6、在每个管中加入650微升wash solution 离心1min转速13000rpm，这一步骤重复四遍，每一次都弃去管底的废液。

7、4次洗完之后，什么都不加再离心一次，1min 转速13000rmp。

8、离心之后取出，放入到新的EP管中，每一个EP管中加入50微升Nuclease-free-water（无核酸酶水）需要提前水浴30min中55摄氏度。加的过程中要充分覆盖管底，静置2min，离心2min，保留EP 管中的液体，此步骤重复两次。（如果要搁置需要保存在-20冰箱中）。

自此DNA已经提取完成。

显影

1、将获得的液体加入PCR混合液中，凝胶电泳，鉴定基因型。

PCR混合液的配制方法ddH2O 9.5微升，Taq12.5微升，上游引物0.5微升，下游引物0.5微升。 每一个EP管中的总量是24微升，提取的DNA 只加1微升。

2、PCR扩增：将样品放入PCR仪扩增。

3、制胶——1%的胶。

小胶：琼脂糖0.25g+25mlTEB1%

中胶：琼脂糖0.5g+50mlTEB1%

大胶：琼脂糖1g+100mlTEB1%

4、将琼脂糖加入TEB溶液后微波炉加热3min，冷却后加入核酸染料EBC，倒入制胶器制胶，30min后取出胶放入电泳槽中，黑线朝向正极。

5、加样，加Maker。

6、电泳。

7、显影。