翌圣，推出一款好酶！

IVD资讯 · 公众号 · · 2024-10-23 13:59

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DNA聚合酶是PCR反应的核心组分，广泛应用于生物及医学研究等领域。对于普通PCR，常规热稳定DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）即可满足需求。但对于高通量测序，扩增产物的准确性非常关键，优选高保真酶进行扩增。常规的高保真扩增酶无法读取和扩增含有尿嘧啶和次黄嘌呤的模板，翌圣生物通过定向改造，推出Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase，该聚合酶可兼容含U碱基模板和常规模板，扩增效率高保真性好，而且酶本身各项残留均很低，满足多种应用方向的扩增需求。

哪些应用方向可优选Hieff Canace® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase呢？

重亚硫酸氢盐转化/酶法转化的DNA扩增-甲基化研究

DNA甲基化测序是研究生物体内基因调控的重要技术手段，越来越多地应用于肿瘤早筛、诊断等技术中。全基因组重亚硫酸氢盐测序（WGBS）是甲基化检测的金标准，在WGBS文库构建过程中，样本DNA经重亚硫酸氢盐处理后，非甲基化的胞嘧啶（C）会转化为尿嘧啶（U），甲基化的C则保持不变。在后续PCR扩增中U会转变为胸腺嘧啶（T），但常规高保真酶不能以含有dUTP的DNA作为扩增模板，因此需要经过特殊改造耐受dUTP的酶，从而应用到甲基化文库构建或者定点突变等技术中。

DNA甲基化建库常用到两种建库方法，甲基化单链建库和甲基化双链建库，单链建库技术主要针对BS转化处理后的单链及损伤DNA进行最大程度的利用和转化，步骤包括甲基化转化（使未甲基化的C转化为U）、变性（双链DNA变性为单链DNA）、3’接头连接、二链合成以及文库扩增。甲基化双链建库则通常是在DNA转化之前或之后进行文库构建，涉及连接甲基化接头、经亚硫酸氢盐或酶法转化处理，再经过一步扩增即可构建针对特定测序平台的甲基化文库。这两种建库的文库扩增都需要用到Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase。

图1.双链甲基化建库文库流程

受损FFPE DNA样本的扩增-肿瘤领域

福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE) 的组织样本是世界各地病理实验室保存临床组织样本的标准方法。随着核酸测序技术的发展引起了人们对使用生物库中存储的历史FFPE样本的兴趣。然而，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本在制备过程中会对DNA造成显著损伤，这些损伤包括：DNA分子链断裂，DNA高度片段化、核酸与蛋白质交联、胞嘧啶脱氨基，即FFPE样本中的胞嘧啶（C）可能脱氨基变成尿嘧啶（U）、氧化损伤、DNA的3'端被封闭、DNA-蛋白质交联。这些损伤会导致从FFPE样本中提取的DNA质量较差，从而影响下游应用，如PCR扩增、测序等。

为了解决这些问题，一种方法是采用修复试剂盒，如Hieff NGS ^® FFPE DNA Repair Reagent（Cat#12606），另一种方法是采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase对含有尿嘧啶的受损DNA模板中进行高保真扩增。

图2.耐U高保真聚合酶扩增受损的DNA模板

防止扩增子的气溶胶污染-病原领域

PCR技术使生命科学领域和研究手段发生了革命性的变化，与DNA克隆、DNA重组、DNA测序、RNA干扰等分子生物学技术一样，成为生物学和医学科学研究领域乃至临床疾病诊断不可缺少的工具。但是扩增产物的污染，是PCR反应中最主要的污染问题，因为PCR产物拷贝量大（一般为1013copies/ml)，远远高于PCR检测拷贝的上限，所以极微量的PCR产物气溶胶，就可能造成假阳性。对于qPCR、RT-qPCR的扩增酶为Taq酶，Taq酶具有耐U的功能，常搭配UDG酶一起使用，Taq酶不具有高保真性，在一些需要保真度高的应用中Taq酶就无法胜任，如针对病原基因组的扩增测序，此时需要采用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase搭配UDG酶进行防污染的高保真扩增。UDG 酶即可将反应体系中已有的dU的DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下 DNA 链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。

图3.多重扩增体系中防污染原理

基于尿嘧啶切除的克隆

基于尿嘧啶切除的克隆依赖于含有重叠序列的PCR产物进行无缝组装，不需要依赖限制性内切酶和连接酶，可用于多个PCR片段的组装、核苷酸序列的修改以及定向克隆。 具体操作流程为：

0 1

PCR引物5′端具有重叠序列，包含一个dU碱基，该碱基在与5′末端6- 10 nt距离处取代dT；

0 2

通过使用Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase进行PCR，在目标DNA分子和克隆载体之间生成6-10个碱基的同源性片段，并且每个PCR产物的5'端被引入了一个dU；

0 3

使用Uracil-Specific Excision Reagent处理PCR片段，在每个dU位置形成单核苷酸缺口，产生适合于PCR片段定向组装的3´单链延伸；

0 4

退火延伸完成组装。

图4.基于尿嘧啶切除的克隆示意图

以上这些应用展示了Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase在分子生物学研究中的多功能性和高效性，使其成为实验室中不可或缺的工具之一。

Hieff Canace ^® Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase不仅应用领域广，而且性能优异，图5中展示了Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase高扩增效率和低残留。

图5.Uracil+ High-Fidelity DNA polymerase高扩增效率和低残留

翌圣，推出一款好酶！

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