上期为大家剖析了基因组组装的基本原理，本期将从实战操作的角度带大家逐步实践宏基因组组装的具体步骤。宏基因组组装一般首先逐个对样本进行组装，再将所有样本中未参与组装的reads混合起来进行组装。
1. 配置config文件
根据质控后的fastq文件（sample1.fq1,sample1.fq2,sample2.fq1.sample2.fq2,sample3.fq1,sample3.fq2）配置每个样本的组装输入文件sample1.config,sample2.config,sample3.config;
Config文件内容如下：
max_rd_len 表示read的最大长度；
[LIB] 表示文库信息标签；
avg_ins 文库中插入片段平均长度
reverse_seq 序列是否需要被反转，0(不反转)，1(反转)，一般插入片段大于等于2k文库，在建库是会将插入片段进行环化，此时须设置该参数为1；
asm_flags 表示reads用于组装哪个部分，可设为1,2,3, 1表示reads仅用于contig组装，2表示reads仅用于scaffold组装，3表示reads同时用于contig和scaffold组装；
rank 构建scaffold时，不同文库中reads的使用顺序，文库中reads序列越短，级别越高；
q1,q2 用于组装的双端fq文件。
2. 软件
安装SOAPdenovo，下载地址 http://sourceforge.net/projects/soapdenovo2/files/SOAPdenovo2/ ;
安装SOAPaligner，下载地址为http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html
1. 对每个样本单独组装
组装命令：
![]()
SOAPdenovo-63mer all –s sample1.config –K 57 –o sample1 -d 1 -M 3 -u –F -p 10
SOAPdenovo-63mer all –s sample2.config –K 57 –o sample2 -d 1 -M 3 -u –F -p 10
SOAPdenovo-63mer all –s sample3.config –K 57 –o sample3 -d 1 -M 3 -u –F -p 10
参数说明：
-s config配置文件；
-K k-mer的长度；
-o 输出文件前缀；
-d [INT], kmerFreqCutoff, 去除频数小于等于该值的kmers，默认为0；
-M [INT], mergeLevel连接contigs时, 合并相似序列的等级，默认为1，最小值为0，最大值为3，
-u 构建scaffold前屏蔽过高或过低覆盖度contigs，默认屏蔽；
-F 利用reads对scaffolds的gap进行填补，默认不执行；
-p 需要使用的cpu数目，默认8；
输出结果文件：
Sample1.scafSeq：scaffold的fasta序列文件；
Sample1.scafStatistics: scaffold和conitg的统计文件，分布统计了scaffold和contig的数目，序列的一些统计信息，GC含量，N50及N90值等；
2. 通过re-mapping获取每个样本未参与组装的reads
比对命令：
2bwt-builder sample1.scafSeq #对scafSeq构建索引;
Soap -p 6 -r 2 -m 200 -x 400 -a ./cleandata/sample1.clean.fq1.gz -b ./sample1/sample1.clean.fq2.gz -D sample1.scafSeq.index -o sample1_PE.soap -2 sample1_SE.soap -u sample1_UN.fasta
参数说明：
-p 处理器数目，默认为1；
-r 比对到多个位置的序列如何输出，1表示不输出，2表示任意输出一次，3表示全部输出，默认为1；
-m 最小插入片段长度，默认400，single-end不需要设置该参数；
-x 最大插入片段长度，默认600，single-end不需要设置该参数；
-a 输入文件，pair-end时，输入其中一端文件；
-b single-end不需要设置，pair-end输入另一端文件；
-D 参考序列索引文件；
-o 输出文件；
-2 输出比对上但是不是成对reads比对上的序列的文件。Single-end不需要设置，因为其输出文件都是不成对的序列文件。
-u 没有比对上的reads；
输出结果文件：
sample1_PE.soap:能比对上组装后的参考序列且reads成对存在的比对文件；
sample1_SE.soap: 能比对上组装后的参考序列但reads不成对存在的比对文件；
sample1_UN.fasta：不能比对上组装后的参考序列，通常为fasta格式；
3. 将所有样本中不参与组装的reads混合组装
首先可以编写个小脚本将不能比对上参考序列中成对存在的reads提取出来，假设样本sample1的unmapping 的成对reads命名为sample1.unmapped.fq1.gz,sample2.unmapped.fq2.gz
配置混合组装的mix.config文件，文件内容如下：
混合组装命令：
SOAPdenovo-63mer all –s mix.config –K 57 –o mix -d 1 -M 3 -u –F -p 10
参数和输出结果文件见单个样本组装部分。
宏基因组组装的实战操作部分就介绍到这里，大家可以动起手来一一实践了，下两期小编将为大家带来宏基因组注释模块，包括物种注释和基因注释两部分，敬请期待！
供稿：协云基因微生物事业部 韩娜
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