引物设计，那些你大概不知道的秘密

引物的设计固然简单，当然，会有一些稍微有点基础的同学，觉得我昨天讲的引物设计太低蜂了。

其实我确实没讲什么，就讲了你们设计引物的时候Tm值最好设计到60℃，别的复杂结构完全可以不用去考虑而已。嗯，确实不难。

但PCR发展了这么多年，难道真的没有什么特别高深的引物设计是你们没怎么听过的么？额，当然有咯。我相信知道这些的人呢并不是很多。

首先来个简单的，你们知道引物的碱基序列一共几个字母么？四个？不，并不是ATCG这四个字母，代表引物序列的碱基一共有16个字母……

ATCG大家都熟悉，那第二行的是什么呢？第二行是简并引物的代表字母。R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W= A/T，H= A/C/T，B= C/G/T，V=A/C/G， D=A/G/T,N=A/C/G/T。

举个例子，比如你设计的要扩增基因，有个碱基不确定，不知道是A还是G，那就用R来表示这个碱基。引物合成公司就会给你合成两条引物，然后混合在一起，这就是简并引物。用简并引物话，无论那个位点是什么碱基，都能扩增。

还有一个是I，也就是次黄嘌呤，这个是可以和ATCG任何一个碱基结合的，可以替代N。

接着，我们讲讲修饰。当然你们会说，我知道！我知道！做探针要用修饰的！加Fam和MGB！

嗯，没错，这个就是初阶的引物修饰——做成Taqman探针。

通过聚合酶的外切酶活性，将荧光基团（如FAM）和淬灭基团（如MGB）分开，使之可以激发Fam的荧光。

当然，这些是你们知道的，可能知识面再广一点的，可能会知道引物的生物素标记或者地高辛标记。这个通常用在Southern Blot的探针上，来替代同位素探针。

除了这些，还有很多种你们基本没听过的修饰方法，比如磷酸化修饰和间臂（Spacer）。引物在3'末端如果加上了这两种修饰的一种，就会导致………………引物没法延伸，也就是没法扩增。

卧槽，引物要是不能扩增，要这种引物有什么用？当然有用咯，一般会把这类修饰的引物作为Blocker，就是竞争性阻碍的探针。比如，我想扩增A基因，但是有个跟A基因同源性特别高的B基因，引物上就差几个碱基。那怎么办？就用Blocker把B基因的引物结合区封起来，无法扩增就OK了。当然如果作为探针的Blocker也可以，因为修饰后，外切酶也切不动了。

还有一种有用的修饰，叫做硫代修饰和氨基修饰。这个估计你们更不会用了，这个都属于课外阅读项目了。首先要了解是，引物结合后，通过聚合酶延伸来进行扩增。

但这个是Taq酶的套路，还有一种高保真酶，是在构建质粒常用的酶。这种酶脾气粗暴，有外切酶活性，就是只要和引物不匹配，那就把模板给锯掉。

但是，一旦用硫代或者氨基修饰后，会抑制高保真酶的脾气，就是不会锯掉模板了。

这有啥用呢？这个一般会用在一种叫做ARMS的PCR上，就是等位基因特异性扩增法。等位基因有碱基的差异（或者是SNP），就把这个差异设计在引物3’末端，并且引入错配，这样一旦3’末端无法结合，那就无法扩增出来了。硫代修饰配合pfu酶扩增，可以使得ARMS的扩增特异性放大，效果相对于普通的ARMS要来得稳定些。

李莫愁博士：如果就是简单的引物设计，我估计你们谁都用不上这些七七八八的修饰以及简并引物。但是知道一点，总比什么都不了解要来得强吧。或许你老板突发奇想，要做SNP检测也说不定呢？好啦，今天就先策到这里吧。