骨骼肌约占人体重量的45%，其损伤会对人体的正常运动、姿势维持和内脏保护功能造成严重影响。轻微的骨骼肌损伤可以通过激活卫星细胞自发修复，但体积肌肉缺失(VML)的治疗必须进行额外的干预。然而，利用原位骨骼肌组织工程策略的VML修复模式需要具有适当成分、结构和生物活性的支架来促进内源性肌肉干细胞的增殖并进一步诱导其成肌分化。现有研究表明细胞外基质（ECM）可以改善VML修复。但脱细胞法获得的支架由于连通性不足，缺乏多孔结构和血管生成，阻碍了支架中细胞的生存能力和功能表达。脱细胞ECM支架的生物学功能也受到免疫原性的影响。相反，构建相互连通的大孔支架，模拟骨骼肌ECM组成和定向微通道结构，并加载多种促进肌肉组织修复的生长因子，有望大大改善VML修复。
针对上述问题，采用单向冷冻和循环冻融相结合的方法，制备了基于苯胺四聚体（AT）改性的酰肼化透明质酸（AHA-AT)、明胶（GT）和氧化普鲁兰多糖（OPU）的可生物降解导电各向异性IPN原位冷冻凝胶，其中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）主要通过物理混合负载，而血管内皮生长因子（VEGF）则与凝胶动态键合。相关研究成果发表于Nano Today上。西安交通大学材料学院赵鑫副教授和前沿科学技术研究院史梦婷博士担任共同第一作者，材料学院硕士生卓劭闻担任第二作者，西安交通大学前沿科学技术研究院郭保林教授担任通讯作者，主要参与作者还有西安交通大学材料学院憨勇教授和西安交通大学第一附属医院骨科尹战海主任。
1、负载双生长因子的可生物降解导电各向异性IPN原位冷冻凝胶的合成
图2 (a) AHA和AHA-AT的FT-IR光谱。(b) OPU、AHA/GT/OPU和AHA-AT/GT/OPU的FT-IR光谱。(c) AHA-AT聚合物水溶液及其掺杂樟脑磺酸溶液的紫外可见光谱。(d) 不同前驱体浓度梯度下AHA/GT/OPU冷冻凝胶的形态结构。(e)细胞在有和没有循环冻融过程的冷冻凝胶内的钙黄蛋白染色图像。(f)经过和不经过循环冻融过程的冷冻凝胶中细胞荧光面积的百分比(n=5)。(g) 不同前体浓度的AHA/GT/OPU冷冻凝胶中细胞钙黄蛋白染色图像。(h) 不同前体浓度的AHA/GT/OPU冷冻凝胶中细胞荧光面积百分比(n=5)。C2C12细胞在(i) 1AHA/1GT/0.12OPU、(j) 2AHA/2GT/0.24OPU、(k) 3AHA/3GT/0.36OPU冷冻凝胶中的取向分布。 *p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。2、导电各向异性冷冻凝胶的电导率、机械性能、溶胀、降解特性及IGF-1和VEGF的释放
图3 (a) 冷冻凝胶的导电性。平行和垂直于(b) 非冻融AHA/GT/OPU、(c) AHA/GT/OPU、(d) AHA-AT5/GT/OPU、(e) AHA-AT10/GT/OPU、(f) AHA-AT15/GT/OPU微通道方向的压缩试验。(g) AHA-AT/GT/OPU冷冻凝胶的溶胀率。(h) AHA-AT/GT/OPU冷冻凝胶的体外降解。(i) AHA-AT10/GT/OPU/IG/VE冷冻凝胶中IGF-1和VEGF的体外释放曲线。3、导电各向异性冷冻凝胶对C2C12成肌分化的影响
图4 导电冷冻凝胶对C2C12细胞成肌分化影响的评价。(a) 冷冻凝胶中C2C12细胞的MHC免疫荧光染色图像。(b) 肌管数统计(n=5)。(c) AHA/GT/OPU，(d) 各向同性AHA-AT10/GT/OPU，(e) AHA-AT10/GT/OPU，(f) AHA-AT10/GT/OPU/IG，(g) AHA-AT10/GT/OPU/IG/VE冷冻凝胶中肌管的取向分布。
图5 (a) HUVECs划痕和迁移的代表性光学图像。(b) 各冷冻凝胶组细胞迁移率统计(n=5)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。5、双生长因子负载导电各向异性冷冻凝胶在体内骨骼肌缺失再生中的应用评价
图6 (a) 治疗1周后大鼠胫骨前肌损伤部位的H&E染色图像（黑色箭头：有核肌纤维；红色箭头：新形成的毛细血管）。(b) 1周后每视场新形成的有核肌纤维数量统计(n=6)。(c) 1周后每个视场新形成毛细血管数量统计(n=6)。(d) 治疗4周后大鼠胫骨前肌损伤部位的H&E染色图像（黑色箭头:有核肌纤维;红色箭头:新形成的毛细血管）。(e) 4周后每个视场新形成的有核肌纤维数量统计(n=6)。(f) 4周后每个视场新形成毛细血管数量统计(n=6)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。
图7 (a) 治疗1周和治疗4周后胫骨前肌损伤部位IL-6和VEGF免疫荧光染色图像。(b) IL-6免疫荧光表达的定量统计(n=3)。(c) VEGF免疫荧光表达的定量统计(n=3)。(d)治疗1周和4周后胫骨前肌损伤部位MHC、MyoD和Tnnt的免疫荧光染色图像。(e) MHC免疫荧光表达的定量统计(n=3)。(f) MyoD免疫荧光表达的定量统计(n=3)。(g) Tnnt免疫荧光表达的定量统计(n=3)。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。本研究以OPU、AHA-AT、GT为前驱体，结合单向冷冻和循环冻融技术，成功制备了一系列具有良好力学性能和定向微通道结构、负载IGF-1和VEGF的可降解导电各向异性IPN原位冷冻凝胶。OPU通过席夫碱键动态键合VEGF，而IGF-1主要为原位物理负载，二者可时序释放。在无催化剂的情况下，这些冷冻凝胶基于席夫碱/酰腙的动态共价键进行交联，单向冷冻技术使冷冻凝胶具有各向异性微通道和相互连接的孔隙结构。循环冻融处理增强了冷冻凝胶的细胞粘附和力学性能，并且内部各向异性结构可以诱导细胞沿其取向方向生长。AT的引入可以提高冷冻凝胶的力学性能，使其具有更好的导电性。所有冷冻凝胶均表现出良好的降解性能，其模量与肌肉组织相似。此外，冷冻凝胶具有良好的细胞相容性，AHA-AT10/GT/OPU冷冻凝胶能有效促进C2C12细胞在3D支架中的增殖，并能诱导细胞的定向分布。负载的IGF-1和VEGF因子可以持续有序地从冷冻凝胶中释放出来，进一步促进HUVEC细胞迁移、HMFB细胞增殖和C2C12成肌分化。体内修复胫骨前肌缺损的实验结果证明，含有双生长因子的导电各向异性IPN原位冷冻凝胶可以通过减少炎症反应、促进血管化和成肌分化来促进骨骼肌再生，这些结果表明负载IGF-1和VEGF的导电各向异性IPN原位冷冻凝胶是骨骼肌原位组织工程的优秀候选材料。
感谢国家重点研发计划、国家自然科学基金、陕西省重点研发计划、陕西省自然科学基金、中央高校基本科研业务费专项基金、中国博士后科学基金的资助。
论文信息：
Authors: Xin Zhao†, Mengting Shi†, Shaowen Zhuo, Ruonan Dong, Lang Bai, Meiguang Xu, Nuanyang Wen, Zhanhai Yin, Yong Han, Baolin Guo*
Title: Biodegradable conductive IPN in situ cryogels with anisotropic microchannels and sequential delivery of dual-growth factors for skeletal muscle regeneration
Published in: Nano Today
doi: https://doi.org/10.1016/j.nantod.2024.102407
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