还在用柱状图征服国自然？年年WB、PCR的老套路，专家都审美疲劳了！想要在众多申请书中脱颖而出，让你的预实验结果“貌美如花”，数据“有理有据”？是时候解锁国自然加分技术——多重免疫组化（mIHC）！不仅颜值爆表，更能多层次、多维度地呈现你的科研成果，让你的申请书从此告别平庸！
本期我们就从基金的角度简要汇总mIHC的优势，让你的研究计划更具竞争力！
一、多重免疫组化（mIHC）是什么？
多重荧光免疫组化（multiplex immunohistochemistry, mIHC），又称多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF），是一种结合了免疫组化和荧光标记技术的实验方法，使得可以在单个样本中同时检测多种生物标志物。
其基本原理是基于抗原与抗体的特异性结合，通过不同的荧光标记实现多重标记的目的。
图1 多重免疫组化原理
mIHC技术的工作流程：包括抗原与一抗的特异性结合、二抗与HRP酶的连接，以及通过荧光底物的催化产生可视化信号。通过多轮染色，不同颜色的荧光信号代表不同的生物标志物，实现了在同一组织样本中同时检测多种标志物的能力。
二、mIHC解决什么问题？
通过在组织层面同时进行多个指标的染色成像，可以深入探究组织内的细胞异质性，揭示肿瘤微环境的复杂构成；精确刻画细胞间的相互作用网络，阐明免疫反应的动态过程；并对复杂的免疫结构进行高分辨率分析，如三级淋巴结构（TLS）的精细结构和功能。
1.肿瘤微环境、免疫
案例：
Increased immune infiltration and chemokine receptor expression in head and neck epithelial tumors after neoadjuvant immunotherapy with the IRX-2 regimen. Oncoimmunology. 2018 Feb 21;7(5):e1423173.
通过mIHC对CD4、CD8、CD68、PDL1等指标进行染色，可以研究新辅助IRX-2免疫治疗前后头颈部上皮肿瘤中免疫细胞浸润和相关基因表达的变化。
图2 mIHC显示浸润免疫细胞之间的关系及IRX-2治疗后的增加
2.神经系统
案例：
A manual multiplex immunofluorescence method for investigating neurodegenerative diseases. J Neurosci Methods. 2020 Jun 1;339:108708.
通过mIHC对CP13、NeuN、GFAP等指标进行染色，以研究在神经退行性疾病组织中，多轮免疫荧光染色和抗体剥离过程中的抗原保存和剥离效率。
图3 mIHC检测神经元、胶质细胞及tau蛋白包涵体的共定位
3.与数字病理学结合
案例：
Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Sci Rep. 2017 Nov 14;7(1):15580.
mIHC结合数字病理学技术，可以实现高通量的全切片成像和分析，提供定量和空间分辨的组织细胞计量学数据，达到空间蛋白质组学的效果。
图4 通过mIHC与数字病理学相结合检测前列腺癌组织中的免疫细胞
三、实验方法描述
在拟定基金研究方案时，可对多重免疫组化（mIHC）技术作如下阐述：
在经过脱蜡和水化处理的组织切片上进行抗原修复，将切片浸入pH 6.0柠檬酸缓冲液中，置于压力锅中加热15分钟后自然冷却至室温。随后用3% H2O2溶液处理切片10分钟进行过氧化物酶阻断，PBS洗涤3次每次5分钟。应用5%山羊血清进行封闭，室温孵育30分钟。
之后进行主要抗体孵育，将稀释的第一种主要抗体应用于组织，4°C孵育过夜。PBS洗涤后，应用HRP标记二级抗体室温孵育30分钟，再次PBS洗涤。随后应用TSA-荧光染料，室温孵育10分钟。完成一轮染色后，将切片置于抗原修复缓冲液中微波加热10分钟进行抗体剥离。
重复上述步骤进行多轮染色，每轮使用不同的TSA-荧光染料。最后用DAPI进行核染色，室温孵育5分钟。使用防淬灭封片剂封片，在多光谱成像系统上采集图像，并用专门软件进行图像分析，包括光谱解混、细胞分割和表型分类。
注：可以选择相同种属来源的抗体。
四、文章案例
如果大家希望参考具体的研究实例，以下列举了几篇运用多重免疫组化（mIHC）技术的代表性文献：
1. 肿瘤免疫：
Comparison of Biomarker Modalities for Predicting Response to PD-1/PD-L1 Checkpoint Blockade: A Systematic Review and Meta-analysis
2. 类风湿关节炎（RA）
Role and Therapeutic Potential for Targeting Fibroblast Growth Factor 10/FGFR1 in Relapsed Rheumatoid Arthritis
3. 单细胞转录组学联合mIHC图像分析
Single-cell transcriptomic analysis of mIHC images via antigen mapping
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