科研经验
|
文献
|
实验
|
工具
|
SCI写作
|
国自然
作者：子非鱼（转载请注：解螺旋·医生科研助手）
我们都造，细胞君素来脾气火爆不好惹，一个不高兴就死给你看。人生百态，死法万千，但对于细胞而言，谢幕的方式主要有两种：凋亡&坏死。相比于简单粗暴、极其惨烈的坏死之法，凋亡则是有计划的优雅老死的一个过程。
细胞凋亡打包于无形，消匿于免疫，凋亡联自噬，回收再利用，维持体内稳态。一旦它状况百出，许多面目狰狞的疾病就纷至沓来，如老年痴呆或肿瘤君的造访就与凋亡过多或过少有着千丝万缕的关系。
因而，为保机体内一方安定，各位带着尚方宝剑的使者（凋亡检测方法），应研究者们之命，誓将细胞凋亡的背后真凶缉拿归案。
细胞凋亡
#1使者熟知凋亡细胞的各种形态、姿势，身背照妖镜（各类显微镜），对行来过往的细胞进行逐个排查。只要细胞皱缩、变形、空泡化，抑或裂解为凋亡小体，那都逃不过光学倒置显微镜的火眼金睛。
而且还有吉姆萨染色、瑞氏染色等两位“助攻”齐上阵，将凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状等典型形态一展无遗，以确保没有漏网之鱼。
当然这还只是#1使者小试牛刀，真正的大招在后面。当它以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况时，就会祭出两大神器：荧光共聚焦激光扫描显微镜和透射电子显微镜。此种神器一出，凋亡细胞纷纷束手就擒。
前者可让安装过“GPS定位器”（特异性染料—Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI，可非嵌入式结合A-T碱基区）的DNA在受到紫外线激发时会发射明亮的蓝色荧光。
同时，电镜下可看到凋亡细胞体积变小，表面微绒毛消失，细胞质浓缩。
都说男女搭配，干活不累。这不，#2使者Annexin V（Ca+依赖的磷脂结合蛋白）就经常与其搭档PI（碘化丙啶）染料共同捕获凋亡细胞。之所以将这两位称为细胞界的“黑风双煞”，是因为只要他俩一出手，就能将凋亡早晚期细胞和死细胞区分开来。
常言道，不怕神一样的敌人，就怕猪一样的队友。每当“猪队友”磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内翻转到细胞膜外时，就会不自觉地泄露细胞凋亡的蛛丝马迹，而且它本身也会很快被高亲和性的Annexin V逮个正着，同时也会产生绿色荧光。虽说当细胞膜完整时，PI暂无用武之地，但一旦细胞膜破损后，PI就会趁此机会混入细胞核内部，而后嵌入dsDNA释放红色荧光。
细胞开启花样作死之路，线粒体居功至伟。这个一眼看去像花生的线粒体可是细胞生命活动的控制枢纽，不仅掌控着细胞能量代谢，还是细胞凋亡调控中心。
现已知晓，一向狡猾的Bcl-2家族会通过各亚家族成员（Bad与Bax亚家族成员）里应外合来获取情报，并改变线粒体膜的通透性，致使跨膜电位（Δψm）消失，开启渗透转运孔（PT pore）并释放间谍分子：细胞色素C（Cytc）和AIF，进而诱导Caspase凋亡信号通路的级联发生。
因此，#3使者（一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、JC-1、TMRM等）常会单枪匹马地深入虎穴来验证细胞是否发生凋亡：正常细胞中，他在线粒体形成聚集体，发出强烈红色荧光；而细胞凋亡时，因电位的消失，他以单体形式存在于胞质中并发出绿色荧光。
然而，#4使者则另辟蹊径，它对释放的间谍分子采取着紧迫盯人的方式，用相关试剂盒分离出细胞中的线粒体和细胞质成分，再通过SDS-PAGE电泳对其进行分开审讯，最后用专门的抗体“锁链”——Cytochody将细胞色素C（Cytc）缉拿归案。
除了线粒体，Caspase家族也经常为细胞凋亡“出谋划策”。因而，只要Caspase身份败露，那么其凋亡罪名跑不了，且不同的caspase的激活还能用来区分凋亡的信号通路，比如：caspase-8活化代表细胞外凋亡信号通路，caspase-9活化则代表线粒体信号通路。
而#5使者的重心在于抓捕Caspase-3，为了让其现身和坦白从宽，western blot、流式细胞术等手段轮番上阵，这才知晓Caspase-3正常以酶原（32kD）的形式存在于胞浆中，在凋亡早期被激活后，可裂解为两个大亚基（17kD）和两个小亚基（12kD），而在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。
