仁济医院在Science子刊发表免疫治疗研究，多层次实验设计验证思路，值得我们学习~

i生信 · 公众号 · · 2024-09-20 10:59

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免疫治疗一直是肿瘤领域临床和基础研究的热点领域，而围绕如何提升肿瘤免疫治疗效果也有非常多不同的策略，如诱导肿瘤细胞免疫原性死亡、增加免疫细胞浸润、调控 PDL1 等免疫检查点表达、抑制免疫抑制微环境（细胞与成分）、增加免疫细胞识别、活化和杀伤等。

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今天我们通过 仁济医院 新近发表在 Science 子刊 Sci Transl Med （中科院一区、 IF 15.8 ）上的研究，看一下如何开展肿瘤免疫和免疫治疗相关研究。

研究发现 蛋白酪氨酸磷酸酶受体 T （ PTPRT ）缺失通过调节 STING 通路增强非小细胞肺癌（ NSCLC ）对抗 PD-1 治疗的敏感性 。

发现 PTPRT 缺失的肿瘤细胞表现出 DNA 损伤累积、胞质 DNA 释放增加、肿瘤突变负荷增加， STING 通路活化后释放更多 IFN- β、 CCL5 和 CXCL10 ，增强免疫细胞浸润，尤其是 CD8+T 细胞和自然杀伤细胞，从而提高 PD-1 治疗的效果。

即研究的作用信号轴为： PTPRT 缺失—— DNA 损伤、胞质 DNA 释放—— STING 通路活化—— IFN- β、 CCL5 和 CXCL10 等增加——免疫细胞（ CD8+T 和 NK ）浸润增加——提高 PD-1 抗体治疗效果 。

因此，研究的关键科学问题为： PTPRT 缺失如何通过激活 STING 通路改善提高 PD-1 抗体治疗效果？

围绕这一关键科学问题，我们通过问题来看一下研究团队开展的工作。

首先是 Q1 ： 研究团队是如何选择 PTPRT 的？

即为何选择和确定 PTPRT 作为研究对象，而不是其它基因 ？

受体型蛋白酪氨酸磷酸酶 RPTPs 有 20 个成员，先前研究发现 PTPRT 去磷酸化 STAT3 的 Y705 位点和 paxillin 的 Y88 位点，调节细胞增殖、粘附和存活等过程。需要注意的是： PTPRT 突变在多种癌症类型中普遍存在（结肠癌 11% ，肺癌 10% ，食管癌 11% ，胃癌 9% ，子宫内膜癌 8% ，头颈癌 6% ），并且磷酸酶结构域的突变降低了其酶活。

研究团队首先通过发现和验证队列基因突变进行分析，在这些基因中， PTPRT 突变是唯一在 CR/PR 和 DCB 组中显著富集的基因：

发现和验证队列中 PTPRT 突变患者比 WT 患者的 PFS 更长，且磷酸酶突变（ P-mut ）患者比 WT 患者的 PFS 更长：

进一步分析发现 PTPRT 缺失的 NSCLC 患者中对 PD-1 抗体治疗更容易获益， PTPRT 状态可作为预测抗 PD-1 治疗反应的一个独立标志物。

到这里，研究已经发现 PTPRT 缺失的非小细胞肺癌（ NSCLC ）患者对 PD-1 抗体治疗获益。

接下来的问题是 Q2 ： PTPRT 缺失 是如何让 患者对 PD-1 抗体治疗 获益的？

这里有个非常关键的考虑角度：体细胞非同义编码突变产生的肿瘤特异性突变肽（新抗原）的更高负担可能会增加肿瘤的免疫原性，这些癌症患者更有可能从免疫检查点疗法中获益。而 P-mut 突变组的非同义编码突变等比例都最高：

因此重点关注 PTPRT 是否对 DNA 损伤或肿瘤突变负荷（ TMB ）有影响，这样就把 PTPRT 对免疫治疗响应的问题联系到了 DNA 损伤和肿瘤突变负荷 TMB ，因此下面就是验证 PTPRT 对 DNA 损伤和 TMB 的影响。

因此构建 PTPRT 基因敲除模型，检测了 DNA 损伤标志物 p- γ H2A 的水平，并发现 PTPRT 缺失的细胞中 DNA 损伤增加；通过全外显子测序发现 PTPRT 缺失细胞的肿瘤突变负担（ TMB ）升高：

接下来就进一步探索 PTPRT 缺失后激活 cGAS-STING 通路的机制，同样构建 PTPRT 基因敲除细胞模型，结果发现， PTPRT 缺失的细胞的细胞质 DNA 增加、 STING 增强、下游分子 IRF3 的磷酸化水平升高，同时伴随 STING 靶基因表达的上调，说明 PTPRT 缺失通过促进 cGAS-STING 通路的激活，可能增强肿瘤细胞对免疫检查点抑制剂的敏感性。

然后是 Q3 ： PTPRT 是如何激活 STING 通路的？

研究团队采用液相色谱串联质谱策略来鉴定 HEK-293 细胞中与 PTPRT 相关联的蛋白，结果发现 STING 是 cGAS-STING 通路中唯一与 PTPRT 相互作用的核心成员。接下来，通过免疫共沉淀和质谱确定 STING 与 PTPRT 相互作用，并发现 PTPRT 缺失的细胞中 STING 的 Y240 磷酸化水平升高，而 PTPRT 过表达则降低了这一磷酸化水平，说明 PTPRT 能够直接与 STING 相互作用并在 Y240 位点去磷酸化 PTPRT 。

在此基础上是另外一个问题： PTPRT 降低 STING 的磷酸化，对 STING 蛋白的影响如何？

研究团队注意到在 PTPRT 缺失导致 STING 蛋白增加，但 STING 的 mRNA 表达无改变。于是通过环己酰胺（ CHX ）处理发现 PTPRT 影响了 STING 蛋白的降解。

接下来为了探究 PTPRT 缺失导致 STING 降解的机制，对细胞进行蛋白酶体抑制剂 MG132 和溶酶体抑制剂氯喹处理，发现在 PTPRT 基因敲除细胞中 STING 的降解减少；免疫沉淀实验显示 PTPRT 的过表达增加了 STING 的泛素化，而 PTPRT 基因敲除则减少了 STING 的泛素化；此外 PTPRT 过表达显著降低了 STING Y240 磷酸化与总 STING 的比例，而 PTPRT 基因敲除则增加了这一比例。这些结果表明： PTPRT 通过调控 STING 的 Y240 位点磷酸化状态，进而影响 STING 的泛素化和蛋白稳定性。

最后动物实验发现 PTPRT 缺失对肿瘤免疫微环境重编程， PTPRT 缺失的肿瘤细胞在免疫能力完整的小鼠模型中促进了免疫细胞的浸润，特别是 CD8 T 细胞和自然杀伤（ NK ）细胞， PTPRT 缺失的肿瘤在抗 PD-1 治疗下显示出更好的疗效，这种效应依赖于 STING 通路。

最后我们做一下这项研究的总结：

1. 这个研究的角度是从 TMB 、 STING 通路的活化与提高免疫治疗效果切入的，与大家关注的免疫检查点的表达、降解不同；

2. 研究有几个环节值得我们注意和思考： a. PTPRT 是磷酸酶； b. PTPRT 的基因组层面变化是点突变，而点突变的结果导致 PTPRT 的活性下降； c. PTPRT 与肿瘤突变负荷 TMB 相关，而 TMB 已知与肿瘤免疫治疗响应率有关； d. PTPRT 的直接底物是 STING ，通过去磷酸化导致 STING 蛋白的泛素化降解。如果我们也要开展这样的研究，以上这些环节中，要先做哪个？

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