电荷异构体特别是酸性电荷变体，是重组单克隆抗体生产中的关键的质量属性之一，可以影响抗体在体内和体外的性质，同时，电荷异构体是抗体经过各种翻译后修饰及化学降解的累积结果。本文研究了流加培养条件下，降低稳定期的细胞培养pH，对酸性电荷异构体的影响及其作用机制。首先，本研究在2L反应器培养过程中降低稳定期培养pH，通过弱阳离子交换色谱对产物的电荷分布进行描述并寻找差异；其次，借助多种分析方法解析酸性变体同主峰之间的主要结构差异，并从产物翻译后修饰和化学降解的角度解释酸性变体含量随pH下降而减少的作用机制。
单克隆抗体（mAb）：动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
电荷异构体：由于单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构 体。这些异构体可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺，也可能来自于纯化、制剂等制造过程以及贮存过程的任何阶段。其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。
图1
为不同pH条件下流加培养过程中，a活细胞密度 b细胞活性 c mAb浓度。■表示pH=6.95±0.1（对照组）▲表示PH=6.75±0.1（实验组）。误差线为三个独立实验的标准方差。*p<0.05表明与对照组相比有显著差异（student’s t 检验，n=3）
图2
为不同pH条件下流加培养过程中，从第6天到第14天，单抗的不同电荷异构体分布。a酸性变体含量；b 碱性变体含量；c 主峰含量。白条表示对照组，黑条表示实验组。误差线为三个独立实验的标准方差。*p<0.05表明与对照组相比有显著差异（student’s t 检验，n=3）。
表1
为不同pH条件下，流加培养过程中（14天）的产物聚体及产物中被还原的二硫键的含量。
图3
为不同pH条件下流加培养过程中，N端糖基化含量。a图为纯化后抗体的N端糖基化含量（14天）；b、c图分别为第8天到14天，产物的半乳糖基化含量（b）和岩藻糖基化含量（c）。白条表示对照组，黑条表示实验组。误差线为三个独立实验的标准方差。*p<0.05表明与对照组相比有显著差异（student’s t 检验，n=3）。
表2
为不同pH条件下流加培养过程中，第14天产物单肽段的天冬酰胺脱酰胺化程度。
图4
为离子交换色谱中氨基酸序列为GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK的HC-T35肽段的提取离子图，其包含异天冬氨酸（isoAsp）、天冬酰胺（Asn）和天冬氨酸(Asp)。具体的三重带电离子质谱图如插图所示。
图5
氨基酸序列为GFYPSDIAVEWESN
388
GQPEN
393
N
394
YK的HC-T35肽段的MS/MS质谱图。a 正常肽段 b Asn388位脱氨基肽段 cAsn393或Asn394 脱氨基肽段。
图6
为回收后抗体各部分的的电荷异质性图谱，a为纯化后主峰，b为纯化后酸性峰，c为完整抗体蛋白
