来源：诊断科学
检测特定遗传物质的能力一直是众多领域进步的基石，从基因工程到污染物检测，尤其是在诊断测试方面。
随着定量聚合酶链反应（qPCR）的发展，有时也被称为定量实时聚合酶链反应，这些能力在传统PCR的基础上得到了扩展，提供了更好的检测灵敏度和特异性，重要的是，我们可以对目标序列进行精确的定量。
在本手册中，我们将从qPCR的工作原理、实验要求、数据分析和该技术的应用方面出发，对qPCR技术进行一次全面的解析。
qPCR是一种选择性扩增和定量检测DNA或互补DNA（cDNA）区域的技术。位于感兴趣区域两侧的寡核苷酸引物用于利用DNA 聚合酶扩增序列[1]。
扩增过程的重复循环导致目标区域的拷贝数呈指数级增长，使用嵌入染料或序列特异性探针对其进行追踪，然后在qPCR设备中检测其荧光并绘制输出图形。
RT-qPCR是指定量反转录聚合酶链反应，“RT”不要误认为是“实时”[2]。与使用DNA模板的qPCR不同，RT-qPCR的起始材料是RNA[3]。
因此，在正常的qPCR扩增过程开始之前，协议中包含一个逆转录步骤，将RNA转换成cDNA。这可以在一个反应管中完成（一步法），也可以在qPCR扩增（两步法）的单独反应中依次进行逆转录（图1）。
图1 | 一步法和两步法RT-qPCR的区别，标明了每个反应的组成部分
与标准的PCR设备一样，qPCR设备由一个加热块和盖子组成，便于样品在不同的温度下快速转换，以实现DNA或cDNA模板的扩增（图2）。
图2 | PCR和qPCR的扩增过程是如何进行的，qPCR方案通常包括大约30-40个循环，每次的拷贝数会翻倍
然而，qPCR设备还包括一个荧光源和荧光仪，以激发荧光基团并检测qPCR扩增周期中产生的荧光信号（图3）。
图3 | 基于染料和探针的qPCR检测产生的荧光信号
该设备通常有或与计算机相连，记录荧光仪的输出，并使用软件根据用户定义的信息（如对照孔和标准）来解释实验结果。
► 序列特异性引物：与目标区域的新副本结合并形成基础；
► 脱氧核苷三磷酸酯（dNTP）：新的DNA链的核苷酸构建块；
在许多情况下，使用一种预混合溶液，其中包含聚合酶、dNTPs、缓冲液和（如果适用）染料。
将含有除模板外的所有反应成分的主混合物轻轻混合，并将其等分到反应管中（通常是96孔板）。然后将模板（或在无模板对照的情况下用水，这部分内容见“qPCR对照”）小心地加入相关孔中，并将板或管密封。
如果可能的话，最好以一式两份或一式三份的方式运行样品，以提高结果的可靠性。
被动参考染料（如ROX）包含在许多预制的混合液中。它们提供了一个内部参考，在数据分析过程中可将报告染料信号归一化，以纠正浓度或体积的变化。在不需要定量的情况下，这些可以省略。
用户向计算机/控制单元提供有关孔的内容和位置、使用的染料或探针化学成分、包括的任何标准或对照以及循环条件的信息。
模板DNA或cDNA被加热，导致变性并产生单链DNA（ssDNA）（图2）。结合的嵌入染料（如果存在的话）也会解离，返回到基态。
序列特异性引物与其目标序列结合（退火），互补碱基被DNA聚合酶添加到序列中，产生一个互补的拷贝（引物延伸）。在这个过程中，检测中的荧光基团以一个波长吸收光，如果没有被猝灭，则以更长、更低能量的波长重新发射。激发和发射的波长将取决于所用的荧光基团。
► 在基于染料的方案中，嵌入染料将与新形成的dsDNA结合，当它这样做时就会发光。
► 有许多不同的基于探针的化学制品，然而，它们一般都在类似的原理上工作。某种形式的荧光猝灭确保只有在目标序列存在时才会产生荧光，从而在扩增过程中产生光发射。
然后由荧光仪检测产生的荧光，并由计算机记录。因此，在基于探针的检测中，荧光信号与被扩增的与探针互补的ssDNA片段的数量成正比，而在基于染料的检测中，荧光信号与双链（dsDNA）拷贝的数量成正比。
一旦扩增完成，可对基于嵌入染料的检测产品进行熔融曲线分析，评估dsDNA产品的解离特性。使用嵌入染料，荧光会随着dsDNA链的解离而减少。
50%的DNA变性的温度被称为熔化温度，它将受到qPCR产物序列的影响。样品被逐步加热，通常在65℃至95℃的范围内，并记录对荧光的影响。
熔解曲线分析可以帮助区分非目标扩增。这种方法不能用于基于探针的检测，因为在扩增过程中会产生荧光。
然而，使用扩增后的探针可能有助于使用熔融曲线分析区分扩增子，甚至能够检测单碱基的变化[4, 5]。
设计PCR引物的许多规则也适用于qPCR引物，如：
► 引物要成对设计（一条在正向链上，一条在反向链上），专门用于目标区域的侧翼；
► 引物序列必须选择针对感兴趣的独特序列，避免与类似序列的脱靶结合；
► 引物应具有相似的熔解温度（最好是60~64℃）以实现高效扩增。这受到鸟嘌呤（G）或胞嘧啶（C）与腺嘌呤（A）或胸腺嘧啶（T）的比例的影响，较高的GC含量会提高熔化温度。调整引物长度可以帮助解决引物对中的错配问题；
► 两个引物的退火温度应相似，且不超过引物熔化温度的5℃，以避免非特异性扩增。同样，这也会受到引物长度和成分的影响；
► 在可能的情况下，在引物末端使用G或C，因为它们比A或T（双键）形成更强的（三键），改善引物的结合；
► 如果可能的话，引物序列应避免可能发生二聚化或形成二级结构的区域。这可以用免费提供的引物设计工具来评估；
► 扩增子通常比标准PCR要小（80~150bp）。
► 最重要的是没有脱靶扩增，因为这将影响定量，特别是对于基于染料的检测。
在基于染料的qPCR中，使用一种嵌入染料，在未结合时显示微弱的荧光，当与dsDNA结合时增加到强荧光信号（图3）。SYBR® Green[6]是最常用的dsDNA结合染料之一[7, 8]。荧光与存在的dsDNA数量成正比，能够计算出原始模板数量。
嵌入染料没有序列特异性，所以不需要为个别检测项目量身定做，简化了检测设计。这也使得它们更便宜。然而，这意味着它们会在非目标或非特异性产物以及所需目标的扩增时发出荧光，从而降低特异性。
熔融曲线分析的设施在这里可以提供帮助，特别是在评估新的检测方法时。染料不能用于复用反应，因为与探针不同，信号不能被区分。因此，必须用不同的引物组设置多个反应孔来评估不同的目标。
有许多不同类型的荧光探针和引物化学试剂可用于qPCR，但大多数依赖于某种形式的共价连接的荧光猝灭基团分子，该分子在特定目标序列存在时被释放。
与嵌入染料不同，探针是特异性的，因此必须为每个检测设计，增加了检测设置的复杂性和成本。然而，这确实意味着它们也提高了检测的特异性。
不同的探针通过使用不同的荧光基团可以发出不同波长的荧光，因此只要选择了兼容的探针，并且设备拥有所需的过滤器，它们就可以被复用。
虽然最初的检测开发时间可能更长、更复杂，但多路复用可以通过在一个孔中进行多项测试来减少后续的设置时间和试剂使用。
水解探针，也叫
TaqMan
或5'核酸酶，是最常用的探针类型之一，水解探针包括一个序列特定的荧光标记的寡核苷酸探针，一端是荧光基团，另一端是猝灭基团。
当完整时，猝灭基团会抑制荧光信号。在目标扩增过程中，某些聚合酶的5'到3'外切酶活性会裂解探针，因此荧光基团不再靠近猝灭基团，从而产生荧光信号（图4）。
图4 | 水解探针的工作原理。荧光基团（R）显示为绿色，猝灭基团（Q）显示为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为黄色（粗线），引物为黄色（细线）。
与水解探针一样，分子信标是序列特定的荧光标记的寡核苷酸探针。然而，它们的两端附近有赠送的碱基（5或6个），形成一个发夹结构，使猝灭基团靠近荧光基团并猝灭信号。
当探针与目标序列结合时，茎部变性，使荧光基团和猝灭基团分开，从而产生信号（图5）。由于其结构，分子信标探针比水解探针更难设计。
图5 | 分子信标的工作原理。荧光基团（R）显示为绿色，猝灭基团（Q）为紫色，目标DNA为灰色，引物为黄色。
双重杂交探针也被称为
LightCycler
或FRET探针，这种技术使用一对探针，旨在结合相邻的序列，用供体荧光基团和受体荧光基团对标记，表现出荧光共振能量转移（FRET）。当探针与它们的目标序列结合时，供体和受体染料接近，发生FRET，受体发出荧光（图6）。
图6 | 双杂交探针的工作原理。供体荧光基团（R1）显示为粉红色，受体荧光基团（R2）为绿色，目标DNA为灰色，引物为黄色。
小凹槽结合剂（MGB）探针也被称为Eclipse探针，它们像水解探针一样在两端有一个荧光基团和猝灭基团。
然而，它们在猝灭基团附近也有一个MGB。在没有目标的情况下，MGB探针随机地盘绕，使荧光基团和猝灭基团接近。
当探针与目标物结合时，在MGB的帮助下，探针线性化，允许荧光基团发光（图7）。
图7 | MGB探针的工作原理。荧光基团（R）显示为绿色，猝灭基团（Q）为紫色，MGB为橙色，目标DNA为灰色，引物为黄色。
UniPrimer的一端是荧光基团，另一端是猝灭基团，在未结合状态下形成一个发夹环，猝灭信号。
在第一轮扩增中，目标特异性引物对中的一个（称为Z引物）退火并延伸，产生一个产物。
在第二轮中，这对引物中的另一个引物附着在新形成的产物上并延伸以形成第二条链。
然后，它作为UniPrimer的模板，与Z引物序列结合。延伸导致UniPrimer展开，释放出猝灭的荧光基团（图8）。
图8 | Amplifluor检测的工作原理。荧光基团（R）显示为绿色，猝灭基团（Q）显示为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为深黄色，引物为黄色，Z引物为黑色。
它在对立的两端有一个荧光基团和猝灭基团，形成一个茎环结构，当不与目标结合时，信号会被猝灭。一段与引物结合位点下游和扩增子内的区域相匹配的序列被纳入环路内。
在扩增过程中，该区域与其目标结合，导致环路断开，使荧光基团脱离猝灭基团的影响（图9）。
图9 | 蝎子探针的工作原理。荧光基团（R）显示为绿色，猝灭基团（Q）显示为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为黄色（粗线），PCR阻断剂为橙色，引物为黄色（细线）。
同样，基于LUX的检测的引物之一也充当探针，然而，与蝎子探针不同，它没有猝灭基团。
LUX引物的一端有一个荧光基团，采用发夹结构，本身就能猝灭荧光基团信号。当引物与目标物结合时，它变得线性化，解除了荧光基团的猝灭并产生了荧光信号（图10）。
图10 | LUX探针的工作原理。荧光基团（R）显示为绿色，目标DNA为灰色，扩增序列为深黄色，引物为浅黄色。
在QZyme检测中加入了一个底物，其中包含一个荧光基团和猝灭基团，并保持在接近的位置。
其中一个引物包含了能够裂解底物的催化性DNA区域的反义序列。一旦扩增，该区域就会裂解底物，将猝灭基团与荧光基团分离，产生荧光信号（图11）。
图11 | QZyme探针的工作原理。荧光基团（R）为绿色，猝灭基团（Q）为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为深黄色，引物为淡黄色，互补的催化区为粉色和黄色。
LocNAs是含有亚甲基桥的修饰核苷酸，限制了结构的灵活性（图12）。在探针序列中加入LocNAs可以提高特异性，便于使用较短的qPCR探针，对具有挑战性的序列有帮助。
图12 | 一个LocNAs。修改后的碱基在戊糖环的2′O和4′C之间含有亚甲基桥键（红色）。
在实验装置中包括适当的对照[18, 19]是很重要的，以便能够解释结果和识别潜在的问题。这包括无模板对照（NTC）、阴性对照和阳性对照。
NTC应包含其他孔的所有试剂，但使用PCR级水来代替样品。这些孔应显示无扩增，否则表明一种或多种试剂或用于建立实验的设备被DNA/RNA污染。
阴性对照包含缺乏引物和探针目标区域的DNA/RNA。理想情况下，这与样品在其他方面都是一样的，因此缺乏相关基因（自然或通过基因操作）的同一物种的菌株/个体将是最佳选择。
根据检测方法的好坏，有可能得到非目标扩增，这应该可以从基于染料的检测中的熔融曲线数据中区分出来。如果这种情况发生在常规使用的检测中，选择一个替代的目标序列可能是可取的。
阳性对照[20]应该包含目标序列，并且已知能成功扩增（如果是已建立的检测方法），因为这是未知的信号，将与之比较。
如果检测方法正在开发中，拥有来自其他技术（如常规PCR、下一代测序（
NGS
）或培养）的确认数据表明这是一个阳性样本，可以帮助确认所获得的结果。
如果一个阳性对照未能扩增，那么该运行的结果应该被认为是无效的，因为它表明检测方法有问题。
如果检测的目的是测量相对定量而不是绝对定量，如一些转录研究中的情况，需要一个内源性对照[21]，应该在所有孔中测量。
为此，要选择一个在所有条件下所有样品中转录水平恒定、丰富的基因，如管家基因。然后用它来规范感兴趣的基因的转录数据，以纠正诸如起始材料的数量和反应效率的变化等因素。
许多软件将为你设置必要的分析参数；然而，了解它们的含义、调整可能会影响结果并学会识别潜在的问题是很有帮助的。
从qPCR实验中获得的输出结果将部分取决于所运行的分析类型，但对于所有的实验都应获得扩增图。这显示了在Y轴上产生的荧光信号（ΔRn）的大小，在X轴上绘制了每个孔的扩增周期的过程（图13）。
图13 | qPCR扩增图例，本例显示一组标准品的重复运行，白线表示阈值。
如果包括同一样品的重复，它们应尽可能地接近。重复之间的差异表明可能存在实验误差，可能需要重新进行实验。
同样，重要的是在NTC或阴性对照中没有观察到扩增，而在阳性对照孔中看到一个良好的阳性信号。扩增线跨越阈值的周期数越早，该孔中的目标拷贝数就越高。
如果实验的目的是确定目标物是否存在，并且没有必要进行量化，那么就不包括标准品。许多qPCR软件包包括软件，会自动将这种结果称为阳性或阴性。
当需要定量时，主要有两种选择，绝对定量或相对定量。对于绝对定量[22]，包括标准品以确定未知样品中的目标拷贝数。
标准品使用与未知样品相同的DNA（通常与阳性对照相同），并应涵盖检测的全部能力（其动态范围）的广泛浓度范围，通常为10倍的连续稀释，例如，每孔1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106和1×107个DNA基因组拷贝。
不在这个范围内的样品的定量将不太可靠，因此建议调整未知样品的稀释度，使其进入这个范围并重复测试，由此可以推断出未知样品的数量。
只要用户知道用于制作标准品的DNA库存样品的浓度和基因组的大小（以碱基对为单位），就可以计算每微升的DNA拷贝数。一旦确定了这一点，就可以进行适当的稀释。
将起始量（SQ）的对数与每个标准孔的Ct值作图，并通过数据点画出一条最佳拟合线（图14）。斜率表示检测的效率（E），应该是100%（即每个周期的产物量增加一倍）。
检测应以90~110%的效率为目标，对应的斜率为-3.58~3.10。R2值是标准曲线的相关系数，表明一个数值对另一个数值的预测程度，应尽可能接近1，至少>0.99。
图14 | qPCR标准曲线的例子，起始量（SQ）的对数与Ct值的关系图。
对于相对定量，使用被称为ΔΔCt的归一化。这里，每个孔中所选择的看家基因的Ct值与感兴趣的基因的Ct值进行比较，然后将这些归一化的数值在对照组和未知样本之间进行比较。
使用这种方法，不需要标准，减少了试剂的使用。然而，在开发过程中需要做更多的工作，重要的是要注意这种方法假设所有目标的扩增效率都接近100%，并且相互之间在5%以内。
如前所述，熔融曲线分析可用于检查qPCR产物的身份，对基于染料的扩增尤其有帮助。
阳性对照孔（在设计良好的检测中）应该给出一个漂亮干净的峰值，表明qPCR产物的熔化温度（图15）。
图15 | qPCR熔化曲线分析的例子。解离温度在x轴上表示。荧光的变化表示在右y轴上（虚线）；在低温下，DNA是双链形式，它有100%的荧光，随着温度的升高和DNA的解离而减少。左边的y轴显示Rn，其峰值与qPCR产物的熔解温度相对应。
如果在一些孔中观察到这些以外的峰，说明存在非目标产物，可能意味着这些孔中的定量是不可靠的。同样，如果没有目标峰，说明没有目标扩增子，说明该孔是阴性的。
对于qPCR和PCR来说，扩增过程的发生方式基本相同。然而，两者有明显的区别：
► 对于传统的PCR，有时也称为终点PCR，在扩增过程结束时对产物进行评估，通常是通过琼脂糖凝胶电泳。在qPCR中，测量是在每个扩增周期结束时使用荧光基团进行的。因此，实际扩增过程本身被跟踪，而不仅仅是最终产品；
► 在qPCR中加入已知目标拷贝数的标准品可以确定未知样品的拷贝数，而这是PCR所不能做到的；
► qPCR的检测限通常低于琼脂糖凝胶电泳的检测限（qPCR比PCR更敏感），因此在目标拷贝数较低的情况下，使用qPCR可能是可取的；
► 在一些qPCR方法中加入探针可以使该技术比PCR更具特异性；
► qPCR的扩增子通常比PCR的小（80-150bp，而不是200~1000bp或更多）；
► 与PCR不同的是，PCR的产物经常用于下游实验，如基因工程或测序，而qPCR产物很少用于任何进一步的目的。
数字PCR（dPCR）[23]使用引物和探针，以与qPCR基本相同的方式扩增DNA或cDNA的目标区域。然而，它与qPCR的不同之处在于处理样品和反应的方式以及测量目标的方式。
反应混合物在扩增前被分成许多孔，这样每个孔就像一个独立的反应，每个孔都含有一个或没有目标的拷贝。
该方法依赖于这样一个假设，即样品的分装将遵循泊松分布。扩增后，各孔被记为阳性（荧光）或阴性（无荧光），然后计算来自同一初始样品的所有孔的绝对定量（图16）。
图16 | dPCR实验的工作流程和结果解释。PCR“亮区”信号表示阳性结果，PCR“暗区”信号表示阴性结果。
由于孔被评为阳性或阴性，扩增过程本身不像qPCR那样被跟踪，而是在扩增结束时测量荧光。
同样与qPCR不同的是，dPCR不包含标准，因为量化是绝对的，这节省了时间和金钱，并消除了对校准曲线的依赖。
dPCR的应用包括NGS文库定量、病原体检测和基因转录研究，而且该技术已被证明具有高灵敏度和准确性。
临床研究中的罕见事件检测[24]是dPCR比qPCR更受欢迎的一个领域，这要归功于其卓越的灵敏度。
