蓝晶实验室·iGEM项目解读系列 | 2014 Wageningen_UR

当你每次去超市买香蕉的时候，可能看到的大部分是新鲜完好的样子。实际上香蕉在生长过程中经常受到一种名为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的威胁。这种致病性土壤真菌通过香蕉植株的根系侵染，最终导致植株的枯萎和死亡。香蕉除了是美味的水果外，在许多热带地区不仅具有重要的经济地位，还是饮食的重要组成部分。因此，2014 Wageningen 团队希望设计并创建Banana Guard，用来保卫香蕉正常生长。Banana Guard是一套基于恶臭假单胞菌建立的生物系统，既可以检测土壤中F. oxysporum 的存在，又可以消除病菌威胁。

Flowchart of project

病原真菌 F.oxysporum 分泌的镰刀菌酸是一种通过根系侵入香蕉植物所需的毒素。本项目中获得工程菌株恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）能够感知镰刀菌酸并相应地激活其抗性基因的表达。团队首先通过文献调研发现，在恶臭假单胞菌中，有一系列的基因簇pp1263 - pp1266表达的蛋白可以抑制镰刀菌。然后，通过软件预测这个区域上游的pp1262可能是一个 LysR型转录调控因子。由此，该团队猜测pp1262是否可以通过启动子控制基因簇的表达。基于以上假设，在没有镰刀菌酸的情况下，pp1262蛋白的表达能够抑制pp1263 - pp1266基因簇的转录；而存在镰刀菌酸时，pp1263 - pp1266基因簇可以正常表达。为了进一步验证该系统的工作原理，团队通过实验设计将pp1262和基因间区域置于BioBrick中，以GFP作为报告基因，检测其是否可以受到镰刀菌酸的诱导而启动报告基因的表达。

Hypothetical fusaric acid efflux pump operon present in the genome of Pseudomonas putida KT2440

The complete construct containing both our fusaric acid inducible promoter and a reporter gene

Both P. putida strains are grown in LB medium with 285µM fusaric acid and washed with PBS

实验结果证实：当两种恶臭假单胞菌均在含有285 μM镰刀菌酸的LB培养基中生长时，携带pp1262和基因间区域的实验组有较强的荧光信号值。表明前面的假设是正确的，镰刀菌酸可以诱导pp1262转录因子，从而启动相关基因的表达。

抑制真菌类的病原菌的方法有很多种，2014 Wageningen 团队选择了以下几种方法进行测试。

2,4-DAPG，全称2,4-二乙酰基间苯三酚，是一种广谱抗生素，能够在包括 F.oxysporum 在内的各种植物病原体的生物病害防治中发挥着关键作用，广泛用于农业治理。本项目从荧光假单胞菌中获得控制2,4-DAPG合成的基因簇，并将其导入恶臭假单胞菌，测试其抑制 F.oxysporum 的作用。荧光假单胞菌中phl基因簇包含八个基因，从phlA到phlH，其中 phlABCD参与DAPG的合成途径，phlE编码DAPG的外排泵。本项目将phlABCDE基因簇构建在同一载体中，并导入恶臭假单胞菌种进行了 F.oxysporum 抑菌检测实验。

2,4-DAPG synthesis pathway

Inhibition profiles of F. oxysporum TR4 by 2,4-DAPG P. putida（野生型的恶臭假单胞菌与对照相比，已经有较好的抑菌效果，增加2,4-DAPG合成后，抑菌效果有所提高）

当将甲硫氨酸分解为铵时，会形成甲硫醇作为副产物，然后甲硫醇被氧化后形成DMDS和DMTS。有研究表明DMTS对 F.oxysporum 具有抑制作用，且抑制效果随着时间的延长而缓慢下降。DMDS一般用作植物生长促进剂，同时也对 F.oxysporum 有抑制作用。 DMTS和DMDS都能够在恶臭假单胞菌中天然产生，但是若要达到更好的效果，需要提高DMTS和DMDS的含量。而导致DMDS产率低的一个重要原因是甲硫氨酸-γ-裂解酶对甲硫氨酸的亲和力低，这意味着甲硫醇的转化率较低，从而导致DMTS和DMDS的产率较低。因此，2014 Wageningen 团队决定过表达对甲硫氨酸具有更高亲和力的酶，这种酶是来自 Brevibacterium linens ，已被证明可增加 Lactocossus lactis 中的DMDS产量。

DMDS and DMDT pathway

Inhibition profiles of F. oxysporum TR4 by DMDS/DMTS

P. putida （DMDS/DMTS 组别的抑菌效果明显优于野生型）

Pyoverdines是 P. putida 产生的铁载体，铁载体是指一种可以结合三价铁离子（ferricion）并且供给微生物细胞的低分子量物质。由于铁饥饿，根际土壤中病原真菌和细菌的生长将会受到限制，而铁载体的产生会对 F.oxysporum 孢子萌发产生抑制作用。恶臭假单胞菌WCS358能够产生另一种铁载体蛋白358（PBS358），已被证明可以抑制 F.oxysporum 。铁载体的产生受铁吸收调节蛋白（Fur）的调节，Fur蛋白抑制PfrI的表达，PfrI是激活参与铁载体合成基因所需的转录激活因子。因此，对PfrI进行过表达，可以增加铁载体的产生。

Inhibition profiles of F. oxysporum TR4 by pyoverdine P. putida （与野生型相比，pyoverdine P.putida 具有较小的菌盘， 意味着它的抑制作用增加了，但优势不明显）

几丁质酶是一种水解酶，可以分解几丁质，并在细菌和植物中产生，可用于抑制真菌。 在细菌中，它们的功能是攻击贝类动物或真菌，降解几丁质细胞壁。 在植物中，它们被称为病原体相关蛋白，参与诱导植物系统抗性以保护自身免受病原体侵害。本项目在恶臭假单胞菌中过表达几丁质酶，进行同样的抑菌实验。