真菌虽然烦人，但是不得不说显微镜下是真“美丽”。
病原真菌的一般临床分类
真菌感染的诊断完全依赖于镜下形态和培养特征，而选择和采集合适的临床样本至关重要。许多真菌感染在临床上与分枝杆菌感染症状相似,同一份样本往往同时要做真菌和分枝杆菌培养。如果临床怀疑真菌感染,应按种真菌培养基进行培养。如果样本量不能同时满足镜检和培养,则应优先进行培养。如主要感染灶在肺部,通常应选择呼吸道分泌物进行培养:但值得注意的是,真菌在体内可能播散至远端，所以也可能从非呼吸道部位培养出。
正确采集样本并快速运送到实验室是真菌培养的关键。样本中通常不仅含有病原菌,还含有污染的细菌或真菌。这些微生物的生长会迅速超过生长缓慢的病原性真菌，后者的生存能力随着时间的推移而降低。样本应在收到后2h内进行处理。大多数真菌样本可以在室温下保存。血管内置导管尖端、其他医疗器械(支架、手术植入物、置换关节等)、下呼吸道或尿液样本若不能马上处理,可短暂冷藏保存,但皮肤样本(皮肤、手发、指甲)对低温非常敏感。酵母菌(如念珠菌属)通常可在常规的细菌培养基和真菌培养基上检出。
下呼吸道分泌物
呼吸道分泌物(痰、诱导痰、支气管冲洗液、支气管肺泡灌洗液和气道吸引物)是进行真菌培养最常见的样本。黏稠的下呼吸道样本应用化痰剂预处理并离心浓缩,然后将沉淀物
同时涂布在不含和含有抗生素两种培养基上,后者的作用是防止污染菌的过度生长,以更好地分离目标真菌。应至少接种一块含有抗真菌剂放线菌酮的培养基,用来防止真菌快速生长。每种培养基上都应尽可能接种足量的样本(0.5mL)。囊性纤维化(cystichbrosis,CF)患者中常见的两种真菌是念珠菌和赛多孢。分离念珠菌推荐使用具有选择性和鉴别性的显色培养基,分离赛多孢应选择加入氯硝胺和苯菌灵的赛多孢选择性培养基,以提高CF患者中这两种病原菌的分离。
若样本能在2h内完成处理,可室温保存;如果处理有延迟，应在4℃冷藏保存。
无菌体液(包括脑脊液)
为防止凝固,大部分无菌体液通常收集在肝素抗凝管中，也可用裂解离心管收集。用于培养的腰椎穿刺脑脊液应离心浓缩,取沉淀物接种培养基,培养结果应每天查看。样本量大于2m则推荐离心,每种培养基接种0.5mL的样本。若样本量小于1mL,离心后取沉淀等分后在不同的培养基上各滴1滴。许多实验室使用有螺帽的斜面或培养瓶,以避免培养过程中的真菌污染。用于无菌体液真菌培养的培养基不应含有抗细菌或抗真菌药物。隐球菌可导致脑膜炎,有英结构，可被抗真菌药物放线菌酮抑制
无菌体液样本送达实验室后应及时处理。
如果不能及时处理,样品应室温保存,不可冷藏。
血液和骨髓
播散性真菌感染是住院患者发病和死亡的主要原因,确定病原菌需要依靠血培养。目前，一些全自动血培养系统采用改良的真菌培养基来分离真菌,包括BACTEC(美国BD)BacT/ALERT 3D(法国梅里埃)和VersaTREK(美国赛默飞)都足以分离出除马拉色菌以外的酵母菌。
如果实验室经常能够从血液或骨髓中培养到双相真菌和霉菌,推荐使用解离离心系统,即“Isolator”。骨髓样本建议使用肝素注射管或儿童用Isolator采集。已被证实，Isolator对荚膜组织胞浆菌等丝状真菌的培养效果最好。自动化血培养系统中的真菌培养瓶，如BACTECMYCO/FLytic或BacT/ALERT,也可用于从血液样本中分离丝状真菌。在这些培养瓶中,红细胞和白细胞被裂解,释放出病原微生物，应将培养液离心后转种培养。大多数真菌可在培养的前4d内生长,但荚膜组织胞浆菌需要10~14d才能生长。解离离心系统和血培养系统中的真菌培养瓶均可提高血培养中分离丝状真菌的能力。骨髓样本不应使用全自动血培养系统进行培养。血液真菌培养的最适温度为30℃,建议培养时间为21d。
眼部(角膜刮片或玻璃体)
由医生采集到的角膜刮屑,应直接置于载玻片上镜检,并以“X”或“C”形接种于不含抑制剂的培养基,如沙氏葡萄糖琼脂(SDA)。与处理脑脊液(CSF)本类似,玻体抽吸液应离心浓缩,取沉淀进行涂片和培养。样本应接种于不含抑制剂的培养基、抑霉培养基和含10%绵羊血的脑-心浸出液(BHI)琼脂上。样品应尽快处理,空温保存。不可使用含有放线菌酮的培养基,以防止其抑制潜在病原菌的生长。
毛发、皮肤和指甲刮屑
毛发、皮肤刮屑或组织切片、剪下的指甲样本通常可用于皮肤癣菌培养,
但这些样本可能会被细菌或(和)快生长的真菌污染
。皮肤或指甲破损处的样本可用手术刀片或显微镜载玻片刮取;被感染的毛发应用镊子拔除。应只对皮肤破损处的边缘进行取样,因为病灶中心的病原体存活率不高。样本应置于无菌容器中,不可冷藏。毛发样本可剪成1mm大小,并使用无菌镊子置于培养基上。皮肤和指甲样本应切成更小的碎块,用无菌镊子置在培养基上,并轻压入琼脂中。含氯霉素和放线菌酮的海藻糖琼脂用于培养皮肤癣菌效果良好。如果怀疑糠秕马拉色菌感染,应在培养基的第一区加入橄榄油或一张浸透橄榄油的纸片,在30℃孵育至少21d,才可报告为阴性。
此前在医院，做皮肤和指甲真菌不少，阳性率还挺高。不过文中提到会被细菌和快生长的真菌污染，那么是否要说，我们的标本处理不当，可能导致我们看到的所谓的“真菌”可能是假阳性？
阴道样本
念珠菌属被认为是阴道内的正常菌群,因此没有临床症状的情况下无需鉴定
。组织胞浆菌病和副球孢子菌病均可导致阴道病变。阴道样本应采用转运拭子采集,24h内送至实验室。拭子在无菌运送管中应保持湿润,以便用于制备湿片。应同时接种选择性和含抑制剂的培养基,筛选念珠菌应使用显色培养基。
这里就涉及到一个问题，那就是既然念珠菌属于阴道正常菌群，没有临床症状的情况下无需鉴定，那么看到整张片子只看到一个真菌孢子，要不要报告？
有些人就自以为是，自作主张，觉得既然是正常菌群，出现一个，可能如何如何，你觉得如何如何，你只能写在备注里面。你看到了，就得报。判断他有没有，那是临床医生的事。
还有人认为怕误导临床如何，如果临床的傻鸟还能被这误导，那就是他丢人现眼，不是你的事。你没有这个责任和义务去承担他的傻逼导致的行为，这是他的问题。
《被讨厌的勇气》一书中阿德勒提出了一个重要的概念叫“课题分离”。简单点说就是把自己的课题和别人的课题分开。
检验人员很多时候就是咸吃萝卜淡操心，真菌看到了就该报告，你管它几个呢？你不报，就是篡改结果，这就是违法你的职业操守的问题。
还有一个我遇到的傻鸟，把免疫结果超过界限一点点的结果，在没有任何其他仪器复查的对比的情况下，擅自改成正常。还说什么为什么0.99就是阴性，1.01就是阳性。把自己擅自该结果的行为，用一些扯犊子的话正当化。
同样的问题，无论是一个真菌，还是1.01的结果，你报告真菌和阳性，是你课题；而医生如何判断是他的课题。
医生一天到晚不是吹牛自己读过的书有几米高，如何如何牛逼吗？作为医生，连检验都不懂，怎么不去死呢？牛逼的医生，肯定比检验人员更懂检验的，你可以观察，喜欢来检验科像个吗喽一样上蹿下跳的都是脑残，没有例外。真正懂行的人，自己都能想明白这是怎么回事，就算真是检验科有问题也不会这么趾高气昂。也就是那些小丑，又不懂又爱装逼，当然，他们多半都是脸被打得跟猴子屁股一样红回去的。丢人现眼的傻鸟，有话不好好说，活该被打脸。
尿液
适合真菌培养的样本有首日晨尿、清洁尿、耻骨上穿刺尿液或导尿管直接导尿。尿液样本在采集后应尽快处理。24h尿和弗利导尿管样本不能用于培养。尿样本定量培养是没有价值的,应离心后用接种环取沉渣接种,以确保可以得到足够的菌落。由于尿液容易被革兰阴性菌污染,培养真菌必须使用含有抗细菌药物的培养基。
如果2h内能完成处理,样本可室温保存;如需延后处理,应在4℃冷藏保存。如果使用尿液运输装置,样品可在室温下保存72h。
组织
组织样本应切碎后进行培养,但要注意不可磨碎。研磨会破真菌结构,导致假阴性。但英膜组织胞浆菌除外,其为胞内菌,需要制成匀浆才能释放真菌菌体。将组织块压入培养基,或部分嵌入培养基中以提供氧分压梯度,30℃下培养21d若临床高度怀疑真菌感染,可延长培养时间)。
培养基和培养条件
微生物实验室中用于真菌培养的培养基种类很多(表58.4)。
为了使效果最优化,应组合选择培养基。
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含和不含放线菌酮两种培养基,前者可抑制某些快速生长的真菌,以更好地分离慢生长真菌。但放线菌酮也可对
某些目标真菌有抑制作用。
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含和不含抗细菌药物的培养基(前者主要用于可能被细菌污染的样本;对于来自无菌部位的样本,则无需选择)。
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比SDA抑制细菌能力更强的培养基。
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氯霉素是细菌生长抑制剂,但它对诺卡菌和其他需放线菌同样有抑制作用。
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双相真菌的培养应使用含有抗生素和5%~10%羊血的BHI培养基,其营养更丰富,但促进生长的同时也抑制了产孢。菌落形成后,应立即转种到不含血的增菌培养基后并进行鉴定。
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鸟食培养基用于隐球菌的培养,适用样本为脑脊液、胸膜液、骨髓、组织和下呼吸道样本。
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特殊的显色培养基可用于某些酵母菌的鉴定。
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对于有特殊营养或培养要求的真菌,可能需要增加额外的专业培养基。
平板培养基(培养皿)矩形琼脂瓶和螺帽琼脂管都能够较好地分离真菌,但
首选平板和培养瓶,因为它们通风条件更好、表面积更大,更有利于获得菌落
。在进行显微镜检时,平板培养基更便于操作。真菌培养通常时间较长,培养过程中琼脂会产生脱水现象。因此平板中琼脂容量应至少达到40mL,并放置在加湿培养箱中,以减少脱水。培养基应在经过认证的生物安全柜物安全柜(BSC)中打开。
许多实验室出于安全考虑不使用平板培养基,但该书认为平板培养基利大于弊。
与平板培养基相比,螺帽琼脂管更易储存、所需空间更少、操作更方便且脱水率更低。
大多数实验室工作人员认为在试管中处理培养物危险性更小
。但螺帽琼脂管的
缺点也较多,包括分离菌落的能力差、培养表面积少、促进厌氧菌生长这些都阻碍了其在实验室的常规使用
。如果使用培养管,则应选择尽可能大的型号,以提供足够的表面积。接种后,试管应水平放置1~2h,让样本被琼脂表面充分吸收.防止样本沉淀在试管底部。
室温(最好是30℃)孵育21~30d,方可报告阴性。在培养箱中放置装水的敞口盘,可以使相对湿度在40%~50%之间。.培养期间每周至少检查3次。
如前文所述,
一些临床样本可能被细菌或(和)快速生长的真菌污染
,因此培养基中需要加入抗真菌和抗细菌药物。传统方案中,培养基里分别添加0.5mgmL的放线菌酮和16 μg/mL的氯霉素来抑制污染真菌和细菌的生长。然而,联合使用5g/mL庆大霉素和16mg/ml.氨霉素,对细菌的抑制效果更好。还可使用5mg/mL的环内沙星。
含或不含抗细菌药物的培养基均可添加放线菌酮。但一组培养基中若包含有放线菌酮的培养基,那么也应包含一种不含放线菌酮的培养基。很多致病真菌可被放线菌酮部分或完全抑制,如隐球菌属、克柔念珠菌等其他念珠菌、毛孢子菌属、波氏假阿利什霉和曲霉属。
