Nature Method：双功能化学探针，可捕捉高度紊乱的蛋白质！

奇物论 · 公众号 · · 2024-12-30 22:09

正文

多肽链的折叠是形成功能性三维蛋白质结构的关键。然而除了具有特定结构的蛋白质外，真核生物蛋白质组中还有很大一部分是内在无序蛋白质（IDPs），它们的结构灵活多变，可促进与其他分子的相互作用，进而影响细胞信号通路。然而，蛋白质和IDP的异常折叠与50多种人类疾病有关，包括阿尔茨海默病、帕金森病、II型糖尿病、囊性纤维化、淀粉样变性和某些癌症。

由于缺乏合适的工具，在复杂的细胞环境中识别内源性无序/未折叠蛋白质种类仍然具有挑战性。传统的结构生物学技术（如X射线晶体学和低温电子显微镜）难以应对折叠蛋白的异质性和动态性。基于核磁共振的方法需要表达/标记蛋白质，难以进行大规模蛋白质组分析。虽然基于质谱的蛋白质组学具有全蛋白质组的潜力，但现有方法在处理蛋白质之前往往需要裂解细胞，在捕获折叠物种之前可能会改变蛋白质结构。

来自 澳大利亚乐卓博大学Zhang Shouxiang等人 介绍了一种利用双功能化学探针-TME来捕获、富集和量化细胞内源性蛋白质紊乱的方法。 TME能与环境中含有游离半胱氨酸的蛋白质发生反应，通过荧光开启效应显示蛋白质的紊乱。这种方法即使在丰度较低的情况下也能识别构成性紊乱蛋白质和受应激影响的蛋白质。在帕金森病患者和健康人的淋巴母细胞中，TME在区分两组患者方面优于裂解物分析方法。通过高通量TME荧光和蛋白质组学，作者们揭示了一种细胞质量控制机制，展示了细胞通过调整蛋白质分布来应对蛋白质静态压力的过程。

整体设计策略和工作流程

蛋白质紊乱的特点是结构灵活性和动态性增加。该研究的目标是创建一种既能检测固有未折叠蛋白质，又能检测主动折叠过程所产生的蛋白质的方法。新方法应该：(1)在活细胞环境中捕捉未折叠蛋白质而不引起结构变化；(2)表现出高灵敏度，能识别不同丰度蛋白质中的紊乱区域，包括经常被忽视的低丰度蛋白质；(3)具有多功能性，能以高通量方式研究不同细胞类型中的蛋白质紊乱。

该研究创建了一种新型化学探针，命名为TME，它由一个四苯基乙烯（TPE）荧光团、一个马来酰亚胺（MI）基团和一个炔烃组成。TPE是一种聚集诱导发射荧光团，当分子内运动受到限制时就会发射荧光。由于TPE体积较大，MI基团可选择性地与柔性环境中的游离半胱氨酸发生反应，从而增强了特异性。炔烃可连接到生物素叠氮化物上，用于亲和纯化和基于质谱鉴定标记的未折叠蛋白质。

这种设计实现了两步荧光活化过程--与硫醇反应以消除MI基团的光诱导电子传递淬灭效应以及与蛋白质而非小型生物硫醇反应。更重要的是， TME独特的炔柄可通过铜催化叠氮-炔环加成（CuAAC）与生物素叠氮化物轻松接合，从而实现后续的亲和纯化以及基于质谱的TME标记未折叠蛋白物种的鉴定和定量。因此，作者们开发了RUBICON工作流程（图 1c）。首先用细胞可渗透TME处理待研究的活细胞样本（如经应激物处理的细胞系、人体样本），以原位标记内源性未折叠蛋白。第二步，提取蛋白质组并进行体外CuAAC处理。然后用链霉亲和素珠子选择性地富集标记的未折叠蛋白质，并采用蛋白质组学方法进行分析。

图 1 TME的化学结构和RUBICON工作流程

TME 对蛋白质紊乱区域的特异性

该工作用还原性谷胱甘肽（GSH）作为对照，来研究TME与含有埋藏半胱氨酸硫醇的模型蛋白质的反应性。TME的荧光在尿素未折叠的β-乳球蛋白（BLG）上明显增加。TME对半胱氨酸硫醇具有特异性，与原生BLG或GSH的反应极少。与GSH相比，TME与未折叠蛋白质的反应性更高。该探针与DsbA（一种来自大肠杆菌的硫醇氧化酶，包含一个Cys30-Phe-His-Cys33基团，其中Cys30半胱氨酸暴露在表面,Cys33埋藏在蛋白里）表面暴露的柔性半胱氨酸反应明显，与折叠的DsbA相比，与未折叠的DsbA的荧光更强。凝胶内荧光证实了 TME 对暴露的柔性半胱氨酸的选择性标记作用。事实证明， TME荧光有助于研究蛋白质的变性和稳定性，与内在色氨酸荧光测量相比，其选择性更高。

图 2 TME 专门标记位于表面暴露和灵活环境中的蛋白质硫醇

TME 粘合剂含有明显更多的无序区域

该研究旨在确定TME在Neuro-2a细胞中结合靶点的特征，并评估用于分析内源性蛋白质组紊乱的RUBICON工作流程。研究证实了TME的生物相容性、低细胞毒性和富集未折叠蛋白的能力。通过流式细胞仪检测可发现随着TME荧光的升高，蛋白质静态应激因素诱导了未折叠蛋白的积累。使用RUBICON工作流程进行质谱蛋白质组学分析，可识别和量化各种条件下的TME结合蛋白，发现处理后紊乱程度增加的蛋白质。TME结合蛋白富集在与蛋白质质量控制和生物分子凝聚物有关的功能群中。 TME结合蛋白显示出广泛的无序区域、蛋白质-蛋白质网络中的高中心性以及内在无序蛋白质的富集。

图 3 TME粘合剂含有明显更多的无序区域

RUBICON ：一种潜在的疾病检测诊断工具

作者们继续探索了将未折叠蛋白质组作为潜在诊断工具的可能性。通过对特发性帕金森病患者的研究，他们在人类淋巴母细胞上测试了TME和RUBICON，发现TME结合体富集在功能簇中，并且有更多的紊乱区域。这些结合体在蛋白质网络中也显示出更高的中心性。事实证明， RUBICON能有效检测低丰度蛋白质，并聚焦于蛋白质紊乱，有助于区分健康样本和多发性硬化症样本。这些结果表明，RUBICON能够根据复杂临床样本中的分子特征对疾病进行诊断和分类。

此外，作者们还证明了使用TME和RUBICON工作流程分析培养细胞和患者样本中紊乱蛋白质的有效性。通过研究亨廷顿氏病（HD）模型，他们探索了HD相关蛋白的表达如何影响细胞蛋白稳态。他们使用基于流式细胞仪的分析方法，研究了亨廷顿外显子1（Httex1）突变对蛋白质聚集的影响。分析结果显示，根据蛋白质表达水平，包涵体的形成分为不同的阶段。此外，他们还发现，包涵体的形成和易聚集蛋白质的分布有助于减少细胞蛋白质紊乱。该研究强调了致病亨廷变异体形成包涵体的独特模式以及对细胞蛋白质质量控制机制的影响。

Nature Method：双功能化学探针，可捕捉高度紊乱的蛋白质！

正文

请到「今天看啥」查看全文