单克隆抗体和它的小伙伴们

虽然人体能够产生千千万万种抗体，但在我们利用抗体进行疾病的诊断、治疗及预防时，更多情况下需要特异性强、结构均一、可重复大量生产的高纯度抗体。单克隆抗体的出现，解决的抗体制备过程中的特异性和可重复性问题，得到了广泛的应用。

这里介绍单克隆抗体的制备及几种常见的基因工程抗体。

一、单克隆抗体的制备

自单克隆抗体制备技术问世以来，其制备程序基本类似[1]：

首先用提纯过的免疫原对健康小鼠进行免疫。免疫剂量、途径与间隔时间的选择，均以获得高效价抗体为最终目的。在一定剂量范围内，免疫原剂量越大，产生的抗体效价越高。一般被免疫动物的血清抗体效价越高，融合后细胞产生高效价特异抗体的可能性越大，而且单克隆抗体的质量（如浓度、亲和力等）也与免疫过程中小鼠血清抗体的效价和亲和力密切相关。末次免疫后3～4天，分离小鼠脾细胞（B细胞）以进行融合。

与小鼠细胞进行融合的理想的骨髓瘤细胞株需满足以下要求：1.细胞株稳定，易于传代培养；2.细胞株自身不会产生抗体或细胞因子；3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转换酶（hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase，HGPRT）的缺陷株。此外，需与免疫小鼠同源。

融合细胞应处于对数生长期、细胞形态、活性佳。在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。

细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。目前，通常选择PEG用于促进杂交瘤细胞融合，其原理可能是PEG导致细胞膜脂类物质物理结构重排，使细胞膜容易打开，有助于细胞融合。融合反应后，用培养液稀释，消除PEG的作用。

融合后的细胞进行选择性培养，所用培养基为基础培养基内添加次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、甲氨蝶呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）。骨髓瘤细胞合成DNA通常有两条途径，一是利用糖和氨基酸合成核苷酸进而合成DNA，甲氨蝶呤可阻断该途径；当甲氨蝶呤存在时，细胞通过HGPRT和TK（胸腺嘧啶核苷激酶）利用核苷酸的前提合成核苷酸，进而合成DNA。因此，在HAT培养液中，未能杂交的骨髓瘤细胞由于DNA合成途径分别被甲氨蝶呤和HGPRT代谢缺陷所阻断，导致不能合成完整的DNA，不能增殖而死亡。未能杂交的脾细胞（指B细胞）在一般培养基中不能生长繁殖，5～7天内死亡。所以，HAT培养一周左右，仅成功融合的杂交瘤细胞能够存活，达到选择培养的目的。对HAT选择培养后的细胞进行稀释，选择高抗体分泌的细胞株扩大培养或冻存待用。

大量制备单克隆抗体的方法有动物体内诱生法和体外培养法。在动物体内诱生法中，通常选择小鼠作为产抗动物，小鼠腹腔注射杂交瘤细胞，诱生出腹腔肿瘤并产生含单克隆的腹腔积液。在体外培养发中，可将杂交瘤细胞接种到培养瓶并置于培养箱中培养，或进行高密度培养，如利用发酵罐或细胞固定化培养系统，产量可明显增加。

单克隆抗体可按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法。

二、基因工程单克隆抗体

最初制备成功的单克隆抗体为鼠源性抗体，尽管鼠源抗体亲和力强，但在治疗和检测方面都存在一定的缺陷。

鼠源单抗与NK细胞等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）较弱，而且它与补体成分结合能力低，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱。此外鼠单克隆抗体还具有免疫原性，易引起宿主人抗鼠抗体（HAMA）反应[2,3]。这样一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来不良反应，因此鼠源性单克隆抗体在运用临床治疗前还需改善。同样由于HAMA反应，在疾病诊断过程总中使用鼠源抗体会导致部分样本出现假阳性结果。

因此，在鼠源抗体的基础上，人们对其编码DNA进行重组，使抗体部分或全部由人类基因所编码，降低其免疫原性，制备了人-鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。

（A） IgG分子中Fab片段与Fc片段

（B） 非人源、人-鼠嵌合、人源化及全人源抗体的Fab片段来源

人-鼠嵌合抗体： 是用人源基因代替鼠源单抗的恒定区。这样，不仅保留了抗原抗体结合的特异性，又能够大大降低鼠源单抗的免疫原性。其制备原理是，将功能性抗体轻、重链可变区基因分别与人抗体的κ链和重链C _H 1恒定区基因进行重组，克隆到表达载体中，构建成鼠－人嵌合的Fab 基因表达载体，再转入宿主细胞表达。第一个用于肿瘤治疗的基因工程抗体药物美罗华（Rituximab）就是由鼠可变区和人恒定区组成的嵌合抗体。但由于嵌合抗体可变区（V）仍占整个抗体分子的30%，鼠源性部分的框架区（FR）依旧有一定的免疫原性，仍可能诱发HAMA反应。

人源化抗体： 对人-鼠嵌合抗体进一步进行人源化，主要手段是重构抗体和表面重塑技术[4]。重构抗体即互补决定区（CDR）的移植，将鼠抗体的CDR移植到人抗体的相应部位，可使抗体人源化程度达到90%以上，是目前人源化单抗较常用的方法。表面重塑技术是将鼠源抗体FR部分表面氨基酸残基进行人源化改造，以人抗体表面相似氨基酸替换鼠源FR部分与人抗体中差别明显的部分，这种方法能够在最大程度上维持抗体选择性亲和力的同时减少异源性。

全人源抗体： 虽然人源化抗体极大的解决了鼠源性抗体的免疫原性问题，但生产过程中仍有一定的困难。人源化过程需要大量繁复的计算机模拟，并进行不同的氨基酸取代以保持抗体的选择性亲和力，工作量巨大。并且，人源化抗体依旧含有少量鼠源性成分，仍可能引起HAMA反应等。相比之下，所有序列都来源于人的全人源抗体安全性更好，被认为是用于治疗的理想抗体。目前主要通过3种途径来研制：噬菌体抗体库、核糖体展示技术及转基因小鼠制备人源性抗体。

三、小分子抗体及其特性

在单克隆抗体及其人源化的基础上，为了进一步降低免疫原性、降低生产成本、提高产量、优化抗体稳定性等，研发了各种小分子基因工程抗体。主要包括Fab片段、单链抗体及单域抗体。

Fab 片段： 抗体的可变区，是抗体识别与结合抗原的片段，完整的抗体分子经酶消化后，可生成Fab与Fc两种不同片段，如图3。用于酶切抗体的酶主要包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和无花果蛋白酶[6]。其中木瓜蛋白酶消化IgG抗体是用于获得Fab最传统的方法。

Fab分子无需糖基化，可使用原核系统如大肠杆菌进行表达。因大肠杆菌周质能提供氧化环境及形成二硫键所需的硫醇-二硫键氧化还原酶，由大肠杆菌表达系统所产Fab片段均具有完整的立体折叠和链内、链间二硫键，保留抗体识别与结合抗原的能力[5]。Fab片段抗体无Fc片段，极大的降低了其免疫原性，但也因此作为药物在人体内降解迅速，半衰期短。为延长Fab半衰期，可将Fab片段与蛋白结合或将其PEG化。

单链抗体（single chain Fv，ScFv）： 由抗体重链可变区VH和轻链可变区VL通过一段连接肽（linker）连接形成的一条单一的多肽链，是亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位。与Fab相同，ScFv没有恒定区片段，不需要进行糖基化，因此可在原核系统中表达，最常用的表达受体为大肠杆菌[8]。ScFv的主要优点包括：易于构建和表达、分子质量小、穿透力强、特异性好、免疫原性低。但同时，ScFv也有一些缺点，主要包括亲和力较低，较其亲本单克隆抗体，亲和力低10-1000倍；稳定性较差，尤其在37℃时，常有聚集倾向；半衰期短[9]。

单域抗体(single domain antibodys, sdAb)： 是基于单一结构域的识别单元，这种抗体的亲和性较低，还需进行优化。用基因工程方法获得的sdAb主要有三类：

第一类是从骆驼科动物天然缺失轻链的重链抗体（HCAb）获得的重链可变区，即单一的折叠单元，保留了完整的抗原结合活性，是最小的天然抗体片段[10]。HCAb中的这种由重链可变区结合抗原的单一结构域构成的抗体称为单域重链抗体（variable domain of the heavy-chain of heavy-chain antibody，V _H H）。

第二类是从鲨鱼等软骨鱼中发现的无轻链或其他蛋白分子伴随的类似于HCAb的新的或护士鲨抗原受体（IgNAR）获得的重链可变区。

第三类是从人源或鼠源单克隆抗体获得的重链或轻链的可变区，它们虽保留额抗原结合特异性，但因亲和性和可溶性大为下降，实际应用较罕见。

由于骆驼科动物比软骨鱼类更容易饲养和免疫，因而更常被研究人员使用。 sdAb 比scFv结构更简单，易与受体结合等优点，在研发疫苗、治疗药物、诊断试剂和生物技术研究工具等方面均有较大的发展空间。

四、单克隆抗体的命名

与其他大多数药物不同，单克隆抗体的命名基于其来源和靶物质采用了不同的词干。

世界卫生组织的国际通用药物名称（INN）对各词干进行了定义。见表1.

表1.单克隆抗体词干含义表（FromWikipedia）