高活性肽金属离子骨水泥的3D 打印复合支架有助于糖尿病骨缺损的骨血管再生修复

糖尿病 （ DM ） 可引发一系列不利的病理微环境变化，包括骨代谢调节因子表达失调，脂质过氧化作用和氧化应激，破坏骨代谢的稳定性，导致骨质疏松症和骨折的发生率增加。因此， DM 患者的骨缺损和骨折被认为是修复和再生的重要挑战。

近期，来自武汉大学中南医院的李景峰教授团队开发了一种用于糖尿病骨缺损修复的新型 TZGP （ α-TCP/ZnO/GM@P2 ） 复合支架（ Fig 1 ）。 α-TCP 水泥支架、 ZnO 纳米颗粒和负载 P2 （一种新型甲状旁腺激素相关肽） 的明胶微球（ GM ）实现了互补的优势。 TZGP 支架在满足松质骨的机械强度要求的同时，弥补了无机支架中生物活性肽的不足。它的生物相容性得到增强，并且支架具有抗菌和抗氧化特性。因此， TZGP 支架的新颖设计策略为修复糖尿病骨缺损提供了一种很有前途的方法。

首先，研究人员对 3D 打印复合支架的表征进行了检测。 pH 测定表明 ZnONPs 的引入略微增加了 TZ 和 TZG 支架的 pH 值，比 T 支架的 pH 值更接近中性和生理环境的 pH 值（ Fig 2H ）。同时 Zn ²⁺ 的释放动力学表明 TZ 和 TZG 支架都可以在前 3 周内稳定释放 Zn ²⁺ （ Fig 2I ）。 TZG 支架释放的 Zn ²⁺ 浓度略高于 TZ支架 。但是 GM 的引入使复合支架机械性能发生了下降（ Fig 2K ）。 ZnONPs 和 Zn ²⁺ 还可以穿过受损的膜，破坏内部细胞功能，导致细菌死亡（ Fig 2L ），这将有利于预防糖尿病骨缺损中的局部细菌感染。

之后研究人员成功地将 P2 掺入 GM （ GP ）中（ Fig 3A ）。 Zeta 电位测量表明 P2 与 GM 间存在静电吸引，可以促进 P2 缓慢释放（ Fig 3B ）。同时 TZGP 支架与 GM 和 T 支架相比，表面更粗糙，微孔结构更多，有利于细胞粘附和增殖（ Fig 3E ）。活 / 死细胞染色和 CCK-8 结果证明了所有支架组均具有良好生物相容性，但 TZ 和 TZGP 支架更有利于细胞粘附（ Fig 3I-M ）。综上， P2 掺入 GM 形成的 TZGP 支架具有优良的生物相容性和促进细胞增殖的能力，展现出良好的应用前景。

接下来，研究人员评估了复合支架对 BMSCs 的功能调节作用。根据 EdU 结果，高葡萄糖微环境降低了 BMSCs 的增殖和迁移能力，但 TZ 和 TZGP 支架能恢复其增殖活力，尤其是 TZGP 组（ Fig 4A-D ）。 TZGP 支架中的 P2 作为高活性 PTH 相关肽，具有强大的募集 BMSCs 和促进增殖的能力，使其在高葡萄糖环境中对 BMSCs 具有卓越的保护能力。在成骨分化方面， TZGP 组表现出显著的 ALP 活性和钙沉积面积，优于 TZ 组，并更显著地刺激成骨相关基因和蛋白的表达。

高血糖微环境导致过量活性氧 （ ROS ） 和晚期糖基化终末产物 （ AGEs ） 的积累，这经常影响 DM 患者骨缺损部位的血运重建。因此，研究人员对血管再生也进行了研究。 EdU 染色 （ Fig 5A 、 B ） 和 Transwell 测定 （ Fig 5 C 、 D ） 显示 High-G 组人脐静脉内皮细胞 （ HUVEC ） 的增殖和迁移能力严重受损。 T 的干预未能改善这种状态。 TZGP 组显著减轻了 HUVECs 的增殖和迁移抑制。成管实验表明， High-G 组仅形成少量血管状结构， T 和 TZ 组的 HUVECs 中形成少量间歇性血管， TZGP 组形成丰富的连续血管网络（ Fig 5E 、 F ）。这表明添加 P2 赋予了复合支架高效的血管形成能力。同时免疫荧光测定表明， TZGP 支架显著促进细胞中血管生成相关因子 CD31 、 HIF-1α 和 VEGF 的表达（ Fig 5I-N ）。

随后研究人员通过免疫荧光测定评估了高葡萄糖环境中的 DNA 损伤。结果显示， DNA 损伤标志物 γ-H2AX 在 High-G 组的 BMSCs 和 HUVECs 中显著表达，而分裂和增殖标志物 Ki67 的表达水平在细胞核中显著下调（ Fig 6 A-D 、 I-L ）。JC-1 荧光探针测定表明，与 High-G 组相比， TZ 和 TZGP 组的线粒体膜电位有所提高，尤其是 TZGP 组，其中 BMSC 的改善更为显著（ Fig 6E 、 F 、 M 、 N ）。此外，使用荧光探针二氢乙锭 （ DHE ） 检测细胞内 ROS 表达 （ Fig 6 G 、 H 、 O 、 P ）， TZ 组 BMSCs 的 ROS 产生显著降低。

在第 6 周和第 12 周使用显微 CT 和 3D 重建分析评估骨修复。结果表明 DM 组的糖尿病骨缺损部位仅在缺损边缘仅积累了少量骨量。由于缺乏支架支撑，组织迁移到缺损内部的速度很慢，因此很难形成新骨。与 DM 组显著不同， TZGP 组骨缺损定位产生更多的矿化骨组织，支架表面和间隙覆盖更多的新生骨。同时， TZGP 组的支架降解似乎比 T 组更明显，这促进了新生骨组织的逐渐再生（ Fig 7A ， B ）。

最后，研究人员通过病理切片染色评价支架的体内生物功能。 TZGP 组中的支架降解最严重，支架周围和空隙被更多新生组织占据（ Fig 8A 、 B ）。 Masson 染色结果与 HE 结果一致，在 TZGP 组中，支架内部和周围散布着更多的红色和蓝色新骨组织（ Fig 8C ， D ）。此外， RUNX2 、 Col-I 、 CD31 和 HIF-1α 的 IHC 染色反映了成骨和血管生成相关因子的表达（ Fig 8E ）。

综上所述，本研究成功构建了一种用于糖尿病骨缺损修复的新型 TZGP 复合支架，这种新型 TZGP 支架的各个组成部分相辅相成，显著改善了传统纯 α-TCP 支架降解缓慢、缺乏生物活性肽、存在酸性降解产物等不利因素，为难治性糖尿病骨缺损的修复提供了一种新的设计。

文献信息： J. Wang, Y. Xia, Z. Hao, G. Shi, Q. Zhang, C. Wang, M. Zhu, Y. Huang, L. Guo, T. Luan, T. Zhu, H. Dai, J. Li, A Triple-Integrated 3D-Printed Composite Scaffold of High-Activity Peptide-Metal Ion-Bone Cement Facilitates Osteo-Vascular Regenerative Repair of Diabetic Bone Defects. Adv. Funct. Mater. 2025, 2422950.

供稿：高仕杰

审校：陈嵩

编辑：许雅豪