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靶向衰老的MicroRNA/类器官复合水凝胶通过改善软骨细胞稳态修复软骨缺损和预防关节退变

BCML速递 · 公众号 · · 2024-10-20 20:32

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软骨缺损（ CD ）是骨关节炎（ OA ）的常见并发症，其中，软骨形成障碍和细胞衰老被认为是阻碍软骨修复的重要因素之一。现有的治疗手段如异体移植、手术等效果有限，无法根治退行性关节病。因此，临床上需要开发其他有效治疗 CD 的方法。现有研究已证明，人滑膜间充质基质细胞（ SMSC ）在促进肌肉骨骼系统再生修复方面显示出巨大的潜力。然而，退行性骨关节炎的关节中衰老的微环境往往会破坏 SMSC 的成软骨特性，阻碍软骨修复。并且，衰老对骨关节炎的调控机制尚不清楚。因此，探讨 CD 患者细胞衰老的标志物可能为骨关节炎性 CD 患者的软骨修复提供新的视角。为此，来自南京医科大学第一附属医院的孙烨教授团队在本研究中探索患有骨关节炎的 CD 患者的衰老标志物，并开发靶向衰老的 SMSC 类器官水凝胶以促进软骨修复。首先，研究者通过不同组织供体之间的对比，发现在骨关节炎软骨缺损患者的软骨样本中，细胞衰老标志物的表达上调（图 1 ）。这提示，细胞衰老可能在软骨缺损中起作用，抑制细胞衰老可作为一种潜在的软骨修复和再生疗法。

为了进一步研究软骨缺损患者中细胞衰老介导软骨形成的潜在机制，研究者对 SMSC 类器官和过氧化氢处理的 SMSC 类器官的 microRNA 的表达进行分析（图 2A ）。结果发现， miR-24 在过氧化氢处理条件下显著下调（图 2B ， C ），而在 senolytic （衰老清除剂）处理下上调（图 2D ），表明了 miR-24 在软骨再生和软骨修复治疗中的潜力。此外，对软骨样品中 miR-24 的表达水平（图 2 E ）、阳性细胞占比（图 2G ）以及患者的 K-L 评分（图 2F ）进行进一步分析，发现细胞衰老标志物 miR-24 与骨关节炎 CD 患者中的软骨损伤和细胞衰老呈负相关。

此外，研究者基于 Venn 分析和 Cytoscape 软件进一步预测了 miR-24 的潜在靶基因，结果表明 TLR 4 相关炎症反应途径的正调节因子 TAOK 1 是 miR-24 的靶基因（图 3A ， B ）。并且，荧光素酶报告测定分析证实了 miR-24 和 TAOK 1 之间的功能性相互作用（图 3E ）。在 SMSC 和 SMSC 类器官中，衰老清除剂（图 3C ）和 miR-24 模拟物显著降低 TAOK 1 表达，而 miR-24 抑制剂显著增加 TAOK 1 表达（图 3F 和 G ）。与此同时，差异表达基因的 KEGG 分析结果显示出与 Hippo 信号传导途径、细胞衰老、癌症和细胞凋亡密切相关（图 3 H ）。并且， miR-24 表达影响了软骨形成标志物、衰老标志物、炎性标志物和细胞粘附标志物的生物学效应（图 3 I ）。这些数据证实 TAOK 1 是 miR-24 的直接靶点， miR-24 的上调和 TAOK 1 的抑制显著降低了 SMSC 和 SMSC 类器官中的衰老和炎症标志物的水平，促进了 SMSC 和 SMSC 类器官的软骨形成。

构建 3D 培养的 SMSC 类器官并转染 miR-24 模拟物，探索在软骨缺损治疗和软骨形成中的潜在应用（图 4A ）。结果表明在体外实验中， miR-24 可调控 SMSC 类器官的软骨形成并抑制细胞衰老。研究者用过氧化氢处理的 SMSC 类器官模拟软骨退变，其未能达到球状体形状，并且衰老标记物表达丰富。而 MiR-24 模拟物转染的 SMSC 自组装，获得球状体形状，证明类器官具有有限的抗衰老能力（图 4 B ）。此外，与 2D 培养组相比， 3D 培养的 SMSC 类器官表现出更高的抗衰老和软骨生成性能（图 4C-E ）。并且，与过氧化氢处理组相比， miR-24 模拟物转染可减少细胞衰老和炎症，增强细胞粘附，而在相同条件下， SMSC 类器官表现出更好的软骨形成和细胞粘附能力（图 4F ， G ）。

研究者进一步利用 miR-24 PLGA μS （聚乳酸 - 羟基基甲酸聚乙二醇共聚物微球），构建了 miR-24 PLGA μS/SMSC 类器官水凝胶（ MSOH ）（图 5A ），并对其进行表征。结果显示， MSOH 具有良好的形态结构（图 5B ）、力学性能（图 5C ， D ）和生物相容性（图 5 F ）。并且 MSOH 水凝胶中 ACAN 高度表达，显示出良好的软骨生成能力（图 5G ）。

此外，研究者将 MSOH 水凝胶植入大鼠膝关节缺损部位以测试其在体内的软骨组织再生能力。 MSOH 水凝胶组新生软骨较对照组外观更接近正常软骨，且表现出完全的透明状软骨和丰富的 ECM 沉积（图 6A ）。同时，研究者还在体内测试了关节内炎症的炎症标志物（图 6 B-D ）和不同处理组的组织学评分（图 6 E-G ）。其结果表明，与仅负载凝胶或 SMSC 的水凝胶相比， MSOH 水凝胶不仅显示出更好的软骨修复效果，而且在移植后可更好地维持关节功能，且关节内炎症反应较低。

为了进一步研究 MSOH 水凝胶的软骨形成潜力，研究者对含有 MSOH 水凝胶和仅含凝胶的软骨样品进行了基因组学分析。结果显示， MSOH 组显著上调了差异表达的 mRNA ，影响细胞增殖、细胞外基质构建及多条关键信号通路（图 7A-D ）。并且，与单纯水凝胶组相比， MSOH 水凝胶有效抑制了细胞衰老和炎症，提高了软骨形成相关基因的表达（图 7 E ）。进一步分析发现，伴随 miR-24 表达上调， MSOH 水凝胶上调软骨形成相关基因表达，并减少细胞衰老标志物（图 7 F ）。此外， SA-β-Gal 染色和 miR-24 的荧光原位杂交结果也进一步证明 MSOH 水凝胶植入后，减轻了炎性环境和生成软骨细胞的衰老状态（图 7 G-J ），新生软骨细胞中 miR-24 显著上调（图 7 K ）。上述结果表明， MSOH 水凝胶可通过 miR-24/TAOK1 信号轴有效抑制细胞衰老，从而显著促进软骨修复与再生（图 7 ）。

为了探索 MSOH 衍生的软骨细胞的潜在抗骨关节炎机制，基于对基因表达模式的主成分分析，鉴定了具有特异性基因表达谱的 15 个主要细胞簇（图 8A-D ）。为了进一步理解来自水凝胶和 MOG 凝胶组的软骨样品之间的差异，研究者对基因表达数据进行进一步分析（图 8G-N ）发现，水凝胶组中富集了与凋亡、细胞周期和 Wnt 信号通路相关的通路（图 8I-K ），而 TGFβ 信号传导途径、糖酵解和氧化磷酸化（ OXPHOS ）在 MOG 凝胶组中显著富集图（ 8L-N ）。这意味着 MOG 凝胶将通过调节上述这些途径来改变软骨细胞的细胞状态，缓解软骨细胞衰老和减轻软骨和关节退化。

此外，由于不同的软骨细胞可能获得不同的特征，研究者进一步将软骨细胞重新聚集成七个亚群（图 9A ）。在 MOG 凝胶组中鉴定出更高比例的 C1 至 C5 亚群，而 C6 和 C7 亚群在水凝胶组中显著富集（图 9B ， C ），其中 C6 和 C7 被鉴定为衰老和退行性簇（图 9J ， K ）。并且，在软骨细胞中， GSEA 分析进一步证明，与仅凝胶组相比之下，参与谷氨酸代谢、糖酵解和 OXPHOS 的基因在 MOG 凝胶组中显著富集（图 9D-I ）。上述结果从单细胞转录组的角度为 MOG 凝胶在体内外延缓软骨细胞衰老和关节退变提供了机制依据，说明 MSOH 通过调节细胞糖酵解和 OXPHOS 影响细胞周期、铁凋亡和软骨细胞稳态，改变软骨细胞簇频率以延缓细胞衰老，防止关节退变。

综上所述，本研究初步证实了衰老标志物与骨关节炎患者的 CD 密切相关。 miR-24 能够通过抑制 TAOK 1 来抑制细胞衰老和炎症。 miR-24 表达的下调是骨关节炎 CD 患者细胞衰老的标志。靶向衰老 miRNA-24/SMSC 类器官复合物水凝胶（ MSOH ）可通过增强 miR-24/TAOK1 信号通路减轻关节退变，促进骨关节炎微环境中的软骨修复，并通过调节细胞衰老来维持软骨细胞和软骨的稳态，证明了针对 OA 条件下衰老软骨形成的靶向和精确治疗的潜力，为骨关节炎患者软骨缺损修复提供新的思路和解决方案。。

本研究来自南京医科大学第一附属医院的孙烨教授团队完成，并与 2024 年 5 月 29 日在线发表于 Bioactive Materials 。

文献信息 :Ye Sun*, Yongqing You, Qiang Wu, Rui Hu, Kerong Dai. Senescence-targeted MicroRNA/Organoid composite hydrogel repair cartilage defect and prevention joint degeneration via improved chondrocyte homeostasis. Bioactive Materials 2024, 39: 427-442.

供稿：许梦平

审校：李家颖

编辑：胡杰