Notch信号通路与癌症的关系及相应的药物研发

Notch信号通路是多细胞生物体内一类高度保守的信号通路，通过参与细胞间相互作用介导外界环境对细胞的影响和调控，在生物体的早期发育中程序性地操控细胞的命运和组织的分化。而在多种癌症中，该类通路的程序性以各种形式受到破坏，对癌细胞的增殖、抗凋亡、血管新生等多种特征的形成和维持起到一定的促进作用。本文即简述Notch信号通路与癌症的关系，并对基于该信号通路的药物研发状况作一个梳理。

Notch信号通路简介

Notch信号通路的激活涉及两个部分：Notch受体和Notch配体。

Notch受体是一类单次跨膜蛋白。其胞外段（N端）由EGF样重复片段和一个近膜区的负向调节区域（NRR）构成，而NRR是由3个Lin12/Notch重复片段和1个异二聚化区域（HD）组成。胞内段通常由一段蛋白结合RPBJ相关分子（RAM）区域、7个锚蛋白重复片段、1个转录激活区域（TAD）和1个PEST（富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸）降解决定子区域构成。在哺乳动物中，Notch受体有4种类型（Notch1-4），它们在胞外段的区别集中在EGF样重复片段区域；在胞内段中，Notch4缺失TAD区域（如下图）。在表达分布方面，Notch1和Notch2表达较为广泛，存在于多种处于发育阶段和成熟后的器官中；Notch3主要分布在血管平滑肌和血管周围细胞中，Notch4主要高表达于血管内皮细胞中。

在哺乳动物中，功能性的Notch配体有4种，即Delta家族的DLL1、DLL4（DLL3为非典型的配体），Serrate家族的JAG1、JAG2，均为单次跨膜蛋白。人体中的这4个蛋白的结构如下图。相对于Notch受体， Notch配体的表达分布情况人们还没有清楚的认识。

Notch受体的成熟和激活是基于3种不同的蛋白酶：Furin样蛋白酶、ADAM金属蛋白酶家族和γ-分泌蛋白酶。

在Notch受体被从高尔基体向细胞膜转运的过程中，Furin样蛋白酶在其HD区域切割将其切割为成熟且非激活的非共价异二聚体；当膜表面的Notch受体与相邻细胞表面的配体结合后，构象改变，暴露出酶切位点，被ADAM金属蛋白酶切割；紧接着，γ-分泌蛋白酶切割其跨膜区域，从而释放其胞内区域。从膜上被释放后，Notch受体的胞内区域进入细胞核，在其他蛋白的辅助下，启动Notch相关基因的转录。

虽然Notch信号通路原理较简单，但与其相关的机体生命过程则非常多样。它参与机体多个组织和器官的早期发育和功能维持，如神经元的发育和功能、骨发生过程中造血干细胞的扩增和成骨细胞的形成、T细胞的分化、动脉内皮细胞的稳态维持和血管新生等等。

Notch信号通路与癌症的关系

在多种类型癌症中，Notch信号通路平衡受到破坏，而这种破坏主要体现在3个方面：

Notch受体的突变

基于对多种癌症的Notch受体基因进行的测序结果，Notch受体基因的突变情况可大致分为3种模式：

• 第一种是NNR区域的突变，导致Notch受体发生非配体依赖的酶切和激活。有时候，PEST区域也同时会有突变。

• 第二种是PEST区域单独发生突变，使得Notch受体不易被降解。

• 第三种是Notch受体发生失活型的突变，显示其具有肿瘤抑制作用的一面。

根据统计，第一种类型的突变主要发生于T细胞急性淋巴母细胞白血病、血管球瘤、乳腺癌等癌症中，其中T细胞急性淋巴母细胞白血病的Notch1突变频率较高，而血管球瘤的Notch2突变频率较高。Notch3的突变在这几种类型的癌症中都很少。

第二种类型的突变发生在各类白血病、淋巴瘤中，其中以B细胞相关白血病/淋巴瘤为主。突变位置在Notch1或Notch2上。

第三种类型的突变主要发生在鳞状上皮癌、小细胞肺癌、尿路上皮癌等癌症中，其中鳞状上皮癌中主要是Notch1和Notch2的突变，小细胞肺癌和尿路上皮癌则涉及Notch1/2/3的突变。

当然这只是部分工作，相信Notch受体的突变型在癌症中的分布比上述总结所提到的更加广泛和复杂。Notch受体的突变增加了该信号通路的自主性或对外在环境的敏感性，从而导致了下游信号的异常。

Notch受体下游信号通路其他组分的突变

Notch下游信号通路中的突变也在一些癌症中被检测到，如经常性的RBPJ基因拷贝数缺失和RBPJ蛋白表达丧失在部分癌症尤其是一些乳腺癌中被发现。但整体而言，这一类突变较为少见，Notch信号通路中的突变集中在Notch受体上。

Notch配体的过表达

Notch配体中，根据文献报道在多种癌症中过表达的主要是DLL4，其作用主要是促进肿瘤细胞的血管生成。另外一个比较特殊的是DLL3，它不是Notch受体的典型配体，被发现在小细胞肺癌和大细胞神经内分泌癌患者的癌细胞表面有表达，而在正常组织中检测不到，是一个创新的小细胞肺癌的靶点。

以上3种原因单独或共同导致了Notch信号通路的异常。而根据Blacklow教授的综述的总结，异常的Notch信号通路在癌症中所起的作用主要包括：促进癌细胞增殖，帮助癌细胞生存、调节癌细胞的命运决定，维持癌细胞的干性，增加细胞基因组不稳定性，介导癌细胞与基质细胞的相互作用，等等。另外， Notch信号通路也具有抑癌作用，在部分癌症中，Notch信号通路发生了失活突变。

Notch信号通路相关的药物研发情况

靶点和适应症整体分析

整理目前在研的Notch信号通路相关的抗癌药物，总结这些药物针对的靶点，如下：

胞外的药物靶点包括3种Notch受体和1种Notch配体：

3种Notch受体分别为Notch1、Notch2和Notch3，因为癌细胞中Notch受体的突变主要发生在这3个受体上，它们与癌症的关系相对紧密，因此成为药物靶点。

成为靶点的经典Notch配体只有DLL4，因为目前的基础研究表明这个配体与各类癌症的关系最为明显。研究表明，DLL4主要参与癌细胞的血管生成。

胞内靶点只有γ-分泌蛋白酶，信号通路中的其他组分则没有成为临床在研药物的靶点。

从所统计的药物涉及的适应症类型来看（以ClinicalTrials.gov数据为准，剔除已暂停或终止的适应症），除了晚期实体瘤以外（因为一期临床通常不明确区分癌症类型），药物分布最多的5个适应症分别为淋巴瘤/白血病、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和小细胞肺癌。

抗体药物

统计到的在研抗体药物的情况如下表所示，共9个。

已进入三期临床的只有Stemcentrx与艾伯维合作开发的Rovalpituzumab tesirine，它是由抗DLL3的单克隆抗体和DNA小沟结合剂PBD偶联而成的ADC药物。目前各期临床研究的适应症基本为小细胞肺癌，但Stemcentrx也在尝试多种癌症类型（NCT02709889）。这个项目相对特殊，因为DLL3不属于经典的Notch配体，而且Rovalpituzumab tesirine以DLL3为靶点是基于其在部分肿瘤上的特异性表达而非功能。

其余的项目均在一期或二期阶段。从靶点上看，Notch受体方面，Notch1/2/3均有涉及；Notch配体方面，均为DLL4，其中艾伯维的ABT-165和OncoMed Pharmaceuticals /新基的Navicixizumab都是同时靶向DLL4和VEGF的双特异性抗体。

Brontictuzumab和Tarextumab分别针对Notch1和Notch2/Notch3，两者均为OncoMed Pharmaceuticals最初研发并均在2007年由葛兰素史克获得全球开发和商业化权利。其中Tarextumab于2014年被FDA授予小细胞肺癌和胰腺癌的孤儿药资格。

辉瑞的PF-06650808为抗Notch3单克隆抗体与奥瑞他汀（微管抑制剂）偶联而成的ADC药物，目前处于临床一期，用于治疗多种实体瘤。

Demcizumab 由OncoMedPharmaceuticals最初研发，之后其全球开发和商业化权利转移至葛兰素史克和新基。它靶向DLL4，用于胰腺癌等实体瘤的治疗。2014年，它被FDA授予胰腺癌孤儿药资格。

MEDI-0639和Enoticumab也针对DLL4，用于晚期实体瘤等适应症的治疗，但整体不顺利，多个临床试验已经被终止。

ABT-165和Navicixizumab均为同时靶向DLL4和VEGF的双特异性抗体，其设计是基于DLL4可促进肿瘤细胞血管新生的基础发现。同时抑制DLL4和VEGF,理论上可以增强药物对血管生成的抑制效果。这2个药物目前均处于一期临床。

小分子药物

小分子方面，具有代表性的在研药物列表如下：

从小编检索到的小分子药物来看，靶点无一例外都是γ-分泌蛋白酶。究其原因，可能是该信号通路的性质。Notch信号通路较为直接， 3步酶切激活之后，成熟的Notch受体直接参与基因转录，胞内过程只涉及简单的蛋白间相互作用，并无酶类参与。因此，可以作为小分子药物靶点的基本只有γ-分泌蛋白酶。

目前的临床在研的小分子药物均处于较早期的阶段，表中礼来的LY-3039478、默沙东的MK-0752、辉瑞的PF-03084014已进行到临床二期，但这几个药物的所有临床试验整体情况并不十分顺利。

结语

通过对Notch信号通路的抗癌药物研发情况的梳理，小编得到了不少启发，也有一些思考。

首先是基因筛查对治疗方法选择的指导作用。如前文所述，各种类型的Notch受体突变广泛存在于多种癌症中并且分布具有一定的偏向性，因此做肿瘤基因筛查时，Notch受体的突变情况可以作为一项检测指标。当确定癌细胞上具有Notch受体的某种突变型时，我们可以考虑单独或联合使用针对Notch信号通路的药物进行治疗。在精准医疗的巨大风口上，这是一个顺应趋势同时也是合理的策略。

其次是联合用药的尝试。当Notch信号通路的突变与其他的癌细胞特征共存时，可以考虑将针对Notch信号通路的药物与其他抗癌药物联用，尝试更有效的治疗组合。这也符合未来的治疗趋势。

最后是关于针对Notch信号通路的药物的可能副作用的探讨。2015年发表在《Nature》上的文章Therapeutic antibodies reveal Notch control of trans differentiation in the adult lung报道了科研人员利用抗JAG抗体将小鼠肺部的杯状细胞转分化为纤毛细胞，并且证明这是一个不涉及细胞增殖的直接转分化。Notch信号通路作为一个高度保守的直接调控转录的上游信号通路，相比激酶受体、生长因子受体等，对细胞命运的决定更加广泛和深刻，对它的调控和干扰对生命机体的影响更加深入和复杂。因此，以这样的信号通路作为靶点，需要慎重。另外，靶点功能的非特异性也是需要考虑的问题。如γ-分泌蛋白酶，其底物除了Notch受体之外，还有CD44、ErB4、E-Cadherin等，阻断该靶点会对细胞表面的微环境造成巨大的干扰，其副作用也是不可回避。从以往的研发情况来看，Notch信号通路的药物研发终止率确实很高。

当然，随着人们对基础问题的理解的加深，药物研发策略会趋于精细和合理。希望研发人员在这一领域能有能多的收获，更大的成功。

参考文献

[1] Aster J C,et al., The Varied Roles of Notch in Cancer. Annu Rev Pathol. 2017 Jan 24;12:245-275

[2] Rossi A, Rovalpituzumab tesirine and DLL3: a new challenge for small cell lung cancer. Lancet Oncol. 2017 Jan; 18(1):3-5

[3] Therapeutic antibodies reveal Notch controlof transdifferentiation in the adult lung. Nature. 2015 Dec 3; 528(7580):127-31

[4] 药渡、ClinialTrials.gov等网站

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